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(無題) 削除/引用 No.3626-14 - 2014/12/16 (火) 06:45:32 - 匿名さん おおさん ＞それを理想に近いテンプレートだけの効率のいいスタンダードで検量すれば、実際より差が大きくなりますよね。でも今回の場合は差が小さくなっている。 ですが、増幅効率が悪いのがサンプルの本当の姿なら「同じ条件」のSTDである、 相対定量の方が正しい値ではないでしょうか？（文献値とも近いですし） （差が小さくなったのは分母であるリファレンスの方が「実際より効率のいいSTDによる誤差」の影響を受けたのではないでしょうか？） 逆にサンプル中にはcDNAにハイブリダイズしているmRNAや逆転写プライマー等の PCR阻害産物があるので、PCR効率は見た目上高く計算される可能性もありますね。 それでもサンプルとSTDが同じ条件なら効率は変わらないと思うのですが （1wellからでもPCR効率を計算する2nd relative?は手元のPCR装置には入ってないのです） ＞ノーザンやドットブロット 未経験者なので、ちょっと戸惑ってしまいます。。 ＞もるさん 私も80〜120％という基準は好きではありません。Ct値が35辺りになれば一体どれだけズレるのかと思います。 ただ、今回の相対定量では毎回検量線を引いています。絶対定量の方もSTDを使ってそのプライマーセット・PCR RUN自体の増幅効率は算出し、補正しているので、そこに間違いがなければここまで結果に大きなズレは生じないと思うのです。 ところで、私自身は先輩の絶対定量検量線サンプルが合成オリゴDNAなのにも関わらず、PCRはワンステップRT-PCRで行っていたところに大きなズレの原因があるのかなと考えていたのですが、 ここはこれで大丈夫なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3626-13 - 2014/12/10 (水) 02:21:57 - おお >[Re:12] もるさんは書きました : > 同じなのは増幅部位だけという考えもできますよね。 > > 例えば、DNAとしての分子数は明らかにcDNAの方が多くなると思われます。 > そうなれば、プライマーとテンプレートの出会う確率にも影響を及ぼしますからPCRの効 > 率は変わってきます（それなら、なんかキャリアを入れれば良いかもしれません）。 まあそれもわかるのですが、そうすると実際のサンプルやそれをもとに使用した検量線は増幅効率が悪いということですよね。 それを理想に近いテンプレートだけの効率のいいスタンダードで検量すれば、実際より差が大きくなりますよね。でも今回の場合は差が小さくなっている。 それとも相対定量の方は(きっとサンプルからとってるのだと思うけど)高濃度では夾雑物のため効率が悪く、低濃度では効率がよく高く見積もってしまうんでしょうかね。それだと検量線はまっすぐにはならないですね。 でちょっと思ったのですが、実際のサンプルでノンスペを拾ってるかもと。ただ違うプライまーでも同じ結果ともおっしゃってたし。 ちょと実際の量を確かめるなら、ノーザンやドットブロットなどした方がいいかもしれないと思っている次第です。

(無題) 削除/引用 No.3626-12 - 2014/12/09 (火) 18:21:17 - もる 同じなのは増幅部位だけという考えもできますよね。 例えば、DNAとしての分子数は明らかにcDNAの方が多くなると思われます。 そうなれば、プライマーとテンプレートの出会う確率にも影響を及ぼしますからPCRの効 率は変わってきます（それなら、なんかキャリアを入れれば良いかもしれません）。 当然増幅部位以外の鎖長も効率には影響するでしょう。増幅部位のみの100 baseの テンプレートなのかcDNAとしての例えば平均鎖長500 baseなのかでmeltingやanealing のことを考えれば、効率は変わるでしょう。 ということで、十分説明はつくと思われます。現状では上記のように可能性があり過ぎま す。そもそも検量線はどんな実験のときでも、極力サンプルの状態に近づけるというのが 原則なのですから、上記以外の対策（コントロール）にもまだ匿名さんがやられていない 検討項目はあると思います。急がば回れだと思います。

(無題) 削除/引用 No.3626-11 - 2014/12/09 (火) 17:05:59 - おお >[Re:6] もるさんは書きました : > 絶対定量と相対定量の検量線の傾き（増幅効率）に差はありませんか？ > これはpreparationが違えばあり得る話だと思いますが。 そうかもしれないんですが、それでも不思議に思うのは、いずれにせよ同じ配列を増幅しているわけで、それでなぜ増幅効率が違うのか、、、

(無題) 削除/引用 No.3626-10 - 2014/12/09 (火) 15:26:39 - もる ずれましたね。これであうでしょうか、、、。 相対値 　相定増幅効率100% 　絶定増幅効率50% 1 　　　　20 　　　　　　　　20 1/2 　　　21 　　　　　　　　20.5 1/4 　　　22 　　　　　　　　21

(無題) 削除/引用 No.3626-9 - 2014/12/09 (火) 15:24:29 - もる 私は、仮に80%と120%の違いが増幅効率に出ているのだったら、それは結構さが出ることになりませんか？ということを言いたいのです。 例えば 相対値 相対定量検量線のCt（増幅効率100%） 　絶対定量検量線のCt（増幅効率50%） 1 20 　　　　　　　　　 20 1/2 21 　　　　　　　　　20.5 1/4 22 　　　　21 で考えれば、サンプルが同じでもこれらの検量線に値を当てはめれば差が出てしまいます。 ましてや、この考え方で言えばサイクル数（Ct）が乗ってくれば乗ってくるほどその差は激しくなると思われますがいかがですか？ たとえば、20 cycleまわすとして 増幅効率が80ならば1分子は約12万7千分子に 増幅効率が120ならば1分子は約700万分子に となりますよ。その差は60倍です。私の考えは間違っていますか？

(無題) 削除/引用 No.3626-8 - 2014/12/06 (土) 08:19:18 - 匿名さん ＞UCさん リファレンスAの値自体(Ct値)が、処置群VS無処置群で違ったりはしないです 相対定量の方もスタンダードカーブ法で行っているので、補正前のCt値は検量線上のどこにあるか見ています。変に端っこにあるわけでもないです で、 ＞Ct値を相対定量法と絶対定量法とで比べてみて、まずそこでの差がないかどうか、 ですが、実は絶対定量の方は先輩がやったデータで、（可能なら）詳しく教えて貰わなければなりません。ただ、「自分の実験内での信頼性は確保している。間違いはないはずだ」とのことです ただ、ご指摘の通りそこで大きくCt値差があれば、このように結果が違うのだろうとは思います ＞もるさん PCR効率は少なくともどれも80〜120%に入っています（絶対定量のデータもです） ＞おおさん そうですね、私もそう思います。 ところで、検量線の由来を合成オリゴのDNAだったと以前答えたのですが、 先輩の結果報告をみると、ワンステップRT-PCRで行っているため、 合成オリゴはRNAなのかも知れません（以前見た時DNAだった気がしていただけで。すいません、今度確認してみます） ttp://www.takara-bio.co.jp/goods/catalog/pdf/prt1-3.pdf をみると検量線はcDNAでとありますが、ワンステップの場合はRNAを段階希釈することに問題がないような気がするのですが、いかがでしょうか？ また、仮に検量線サンプルがやっぱり合成オリゴDNAだった場合、 ・形状が違うため増幅効率、Y切片等が（検量線だけ）変化→正確な判定ではなくなる ・逆転写反応中に検量線サンプルは増幅（？） の可能性があるのでしょうか？ としても最終的な結果の発現変化量に影響を与える部分は？ですね

(無題) 削除/引用 No.3626-7 - 2014/12/05 (金) 17:47:30 - おお そうですよね、、、わたしもそんな気がしたのですけど、検量線が違うだけですよね究極のところ。

(無題) 削除/引用 No.3626-6 - 2014/12/05 (金) 17:20:18 - もる 絶対定量と相対定量の検量線の傾き（増幅効率）に差はありませんか？ これはpreparationが違えばあり得る話だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3626-5 - 2014/12/05 (金) 17:15:13 - UC 1) リファレンスAの値自体(Ct値)が、処置群VS無処置群で違うとかないですか。 2) ΔCTの値ではなく、まずは、補正前のCt値同士を、相対定量法と絶対定量法とで比べてみて、まずそこでの差がないかどうか、はどうですか。1000倍と50倍だと、Ct値ベースで、10サイクル程度違うか、5-6サイクル違うかなので結構な差ですよね。処置群VS無処置群で極力template量をそろえることが出来れば、内部標準で補正せずとも、Ct値のみである程度の倍率差は推定できると思います。

実は 削除/引用 No.3626-4 - 2014/12/05 (金) 12:53:50 - 匿名さん ＞おおさん 現存のデータでこたえられることは、相対定量の場合 プローブ・プライマーセットを変更し、別の人が行った実験でも 同様の値が得られています （最大で2倍程度の差でサンプル間の差と変わらない） あと絶対定量では5倍ではなく、50倍でした。誤記失礼いたしました 希釈して試してみるのはありかと思うのですが、 そもそも検量線が確保されている中で試してみる価値があるのか 疑問に残るところです（サンプルはすべて検量線内です） 絶対定量は増幅配列の合成オリゴのモル値にアボガドロ数をかけてコピー数としています DNAです ・cDNAではないこと ・cDNA側はRNase処理を行っていないこと ・絶対定量の検量線のみには逆転写プライマーなどの持ち込みがないこと 違いとして想定できるのは私の浅い知識ではその程度です 発現量変化の結果に影響を与えうるのは3番目しか想定できません。 ちなみに既報論文では同様の実験で相対定量で6千倍 同様の実験結果のデータベースアレイ情報（TG-GATE）では15倍でした 発現量の差を見る試験で、手技によりこれほど違いがあるのは驚きです ボスはどの値が真値なのかを気にしています なにかご教授頂ければと思います

(無題) 削除/引用 No.3626-3 - 2014/12/04 (木) 01:10:50 - おお もしどうも改善するところが見えないのであれば、余裕があれば同じ遺伝子の違うプライまーセットを作るか探して、試してみるとか。

(無題) 削除/引用 No.3626-2 - 2014/12/04 (木) 00:08:21 - おお 絶対定量のスタンダードはRNAですかDNAですか? 処置群1000倍に増えたものは1/1000でに希釈すると理論どおり1になりますか?段階希釈でもいいです。

リアルタイムPCRの相対定量・絶対定量 削除/引用 No.3626-1 - 2014/12/03 (水) 21:26:41 - 匿名さん リアルタイムPCRによる解析で相対定量法と絶対定量法で結果が異なった場合 その理由を皆さんはどのように考えられるでしょうか？ �@相対定量法（�刧僂tではなく一回一回Run毎に検量線を引いています） 　　ある薬剤の処置群VS無処置群で 　　あるGene Xの発現量（リファレンスAで補正）は処置群が1,000倍に増えていた �A絶対定量法（コピー数既知の希釈系列をスタンダード） 　　ある薬剤の処置群VS無処置群で 　　あるGene Xの発現量（リファレンスAで補正）は処置群が5倍に増えていた というような結果が出ています。 プライマー・プローブセット・サンプルは同じです。 どちらも検量線はE＝95~105%, R^2＞0.9999 相対定量法の検量線では、10倍階段希釈したものの一番薄いものの濃度を便宜的に1と置いたので、実際にはリファレンスAで1としたものが100コピーでGene Xで1としたものが1億コピーなんてズレが原因じゃないかと一瞬思ったのですが、 結局それでもGene X/リファレンスAの増加"率"って変わらないのでんなわけなかったです。 絶対定量の検量線の範囲が広く、相対定量の検量線の範囲が狭いことを考えると逆転写試薬の持ち込みが与える影響が強く、同等の条件が検量線になっている相対定量が"真の値"に近いかとも思いましたが、 これほど結果が違うと、リアルタイムの検量性自体に疑問が残ります。 いろいろご教授頂けると有難いです。お願いします

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