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(無題) 削除/引用 No.3625-10 - 2014/12/03 (水) 23:21:39 - おお よかったですね。マイクログラムオーダーのDNAは目で見えないこともありますし、まあ見えたということなので。RNAがその状況だとおそらくまだ一緒についてきてるでしょうから、それがあなたの実験でどの程度邪魔か考えながら次のステップに進んでください。RNAのコンタミをふせぐため、白いもやもやしたDNAをガラスのパスツールに絡めて、くっついたDNAをパスツールごと70%エタノールにつけて、軽く風乾したあと水などに溶かす人もいます。

沈殿を得ました 削除/引用 No.3625-9 - 2014/12/03 (水) 21:59:19 - kai エタノールを加えた後の遠心にて沈殿を得ました。 今のところうまくいきそうな気がします。 助けていただいて本当に感謝です！！

オオ様はじめ、みなさまありがとうございます 削除/引用 No.3625-8 - 2014/12/03 (水) 20:55:07 - kai 現在適切と思われるな塩濃度とした細胞を溶かした溶液にエタノールを2倍量加え-20にてインキュベーとしております。 次いで遠心を行い、 ペレットからDNAをキット(カラム精製)を用いて抽出してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3625-7 - 2014/12/03 (水) 19:28:11 - ~ 目的はDNAを得ること自体なのでしょうか？ 例えば目的が定性的なPCR用途に用いるゲノムDNAを得ることであれば、 DNA溶液をナイロンメンブレンにスポットして結合させ、それを洗ってテンプレートにするのも手かもしれません。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC330868/pdf/nar00194-0227.pdf

(無題) 削除/引用 No.3625-6 - 2014/12/03 (水) 15:56:21 - おお >SSC/SDS溶液にて細胞を溶かした溶液に100パーセントエタノールを1：1の比になるように加えれば問題ないでしょうか? エタノールの量は溶液の塩の濃度などによって減らせることもあるでしょうけど、教科書的には1:2ぐらいで加えるのが通常だと思います(2倍量ということ)。イソプロパノールであれば1:0.6-1でいいです。あとわざわざ、適切な塩濃度があれば沈殿すると思いますので、わからなかったら念のため200mMぐらいのNaClとか300mMぐらいのSodium acetateをくわえて...と書いてあげたのに。。。 沈殿からの精製は可能かと思いますが、それをするなら沈殿のまえにある程度手を加えれば更なる精製は必要ないかもしれません。 以前ここで教えてもらったのは、尿素を6Mぐらいになるように加え(私は飽和尿素液を等量加えてます)、さらに上記のように塩を加えて、アルコールで沈殿するという方法です。かなりきれいになる印象があります。

おおさん、７７４Rさん 削除/引用 No.3625-5 - 2014/12/03 (水) 15:45:21 - kai 実験医学オンラインにてこのような一般的エタノール沈殿のプロトコルがのっていました。 https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/nucleic_acid/vol1.html こちらに記載されている方法に準じでエタノール沈殿をやってみたいと思います。

おおさん、774Rさん 削除/引用 No.3625-4 - 2014/12/03 (水) 15:38:57 - kai 早速のご回答ありがとうございます。 早速これから試してみたいと思います。 もう一点伺いたいのですが、 SSC/SDS溶液にて細胞を溶かした溶液に100パーセントエタノールを1：1の比になるように加えれば問題ないでしょうか? それから、仮にエタノール沈殿が成功した場合、この沈殿物にたいしてDNA抽出キットを使用してDNAを精製する事は可能でしょうか。 何卒よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3625-3 - 2014/12/03 (水) 14:52:17 - おお >[Re:2] 774Rさんは書きました : > そもそもプラスミドのミニプレップではsolution IIがアルカリSDS溶液ですので、SSC/SDSは問題ないように思います。 > 除タンパクのためにフェノール・クロロホルム処理をしてからエタ沈で十分PCRの鋳型になると思います。 同じことを書きかけてたら書いてたことがきえちゃったんだなー。適切な塩濃度があれば沈殿すると思いますので、わからなかったら念のため200mMぐらいのNaClとか300mMぐらいのSodium acetateをくわえてアルコール(イソプロでもいいよ)をくわえるといいかとおもいます。除蛋白もわたしもきになってました。

たぶん大丈夫 削除/引用 No.3625-2 - 2014/12/03 (水) 14:42:07 - 774R そもそもプラスミドのミニプレップではsolution IIがアルカリSDS溶液ですので、SSC/SDSは問題ないように思います。 除タンパクのためにフェノール・クロロホルム処理をしてからエタ沈で十分PCRの鋳型になると思います。

SSC/SDS溶液にて溶かしたcellからDNAを抽出したいのですが 削除/引用 No.3625-1 - 2014/12/03 (水) 13:12:33 - kai SSC/SDS溶液にて溶かしたcellからDNAを抽出したいのですが可能でしょうか? wellにて培養した細胞にSSC(Standard Saline Citrate)/SDS溶液を加えて細胞を溶解し、DNA濃度を測定しました。 余っている細胞溶解液(500μlぐらいある)からDNAを抽出しPCRを実施いたしたく思っています。 抽出方法として調べたところ、エタノール沈殿にて出来そうな感じがしましたが、あまり専門的な知識がないため、自信がありません。 どなたかSSC/SDS溶液にて細胞を溶かした溶液からDNAを抽出する方法をご教授いただけないでしょうか? よろしくお願いいたします。

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