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5'RACE、SMART法のプライマー配列 トピック削除
No.362-TOPIC - 2012/04/03 (火) 20:35:57 - TM
5'RACE疑問に思ったことがあるので質問させてください。
クロンテックのＳＭＡＲＴ法なのですが、SMART IV Oligonucleotideの3’側がrGrGrGという配列になっているものがあります。
これはDNAではなくRNAにしてあるということでしょうか？
また、このメリットは何かあるのでしょうか（通常のGGGとの効率の違い等）？
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.362-5 - 2012/04/05 (木) 12:51:08 - TM
AP様

詳しい解説ならびに資料ありがとうございます。
逆転写酵素は、DNAテンプレートとRNA:DNAハイブリッドにおいてDNA依存性DNAポリメラーゼ活性も持つのですね。
疑問が解決してすっきりいたしました。

皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.362-4 - 2012/04/05 (木) 12:20:52 - AP
普通は、reverstranscriptase (RTase)で逆転写し1st strandを合成したあと、2nd strand 合成はDNA polymerase IのようなDNAを鋳型にとるDNAポリメラーゼRNaseHを加えて行う使うわけですが、SMARTではそこも最初に投入したRTaseにやらせてone stepでできるというのがinnovationのひとつのようです。

RTaseは通常DNAを鋳型に取らないのですが、DNA鋳型鎖にRNAのプライマーが付いているとDNA依存的にDNAを合成するそうです。
http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_RT.htm#how%20active
オリゴの3'側が（rG)nになっているのはRTaseにRNAプライマーの足場を与えるためということのようです。
リンク先の説明によると、その活性は大きくなく、目的とする反応に干渉することはあっても、積極的に利用することはないということですが、Clontechはそれを逆手にとって利用しているんですね。それが有効に働くためにSMARTScribe RTaseなる酵素にもなにか秘密があるんでしょうね。

>逆転写酵素はＤＮＡを鋳型として伸長するのでしょうか？
RTaseが鋳型に取り付くためにDNA:RNAハイブリッドが必要で、いったん鋳型に酵素がとりついて伸長反応が始まれば大丈夫ということではないでしょうか。DNA鋳型鎖にRNAのプライマーが付いているとDNA依存的にDNAを合成するといっても、反応が始まればDNAをプライマーとしてそれを伸長していくわけですから。

(無題) 削除/引用
No.362-3 - 2012/04/05 (木) 08:51:20 - TM
ＭＭＭ様

ご自身の経験談もふまえた情報ありがとうございます。
ＤＮＡとＲＮＡで効率に違いも出るのですね。

少し本題とはそれますが、プライマーのｒＧｒＧｒＧの5'側はＤＮＡのままですが、逆転写酵素はＤＮＡを鋳型として伸長するのでしょうか？
プライマーの３’側だけでなく、全部ＲＮＡにしたほうが効率はよいのでしょうか？

どなたか情報があればお教えいただけますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.362-2 - 2012/04/04 (水) 19:31:46 - MMM
逆転写酵素はRNA依存性ポリメラーゼですので、DNA-DNAハイブリッドを
プライムサイトとして重合反応が起こらないため、3'末端をRNAとしているのではないでしょうか？

実際に自作したprimer ( GGG-3')でswitchingを行ったcDNAでは
長鎖の5'RACE産物の出現率が低かった経験があります。

5'RACE、SMART法のプライマー配列 削除/引用
No.362-1 - 2012/04/03 (火) 20:35:57 - TM
5'RACE疑問に思ったことがあるので質問させてください。
クロンテックのＳＭＡＲＴ法なのですが、SMART IV Oligonucleotideの3’側がrGrGrGという配列になっているものがあります。
これはDNAではなくRNAにしてあるということでしょうか？
また、このメリットは何かあるのでしょうか（通常のGGGとの効率の違い等）？
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