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T cell cloning 削除/引用 No.3586-3 - 2014/11/27 (木) 07:34:54 - 東京大学院生 早速お返事ありがとうございます。 Exhaustionとコンタミからのpolyclonalな増殖を簡単にチェックするにはどのような方法がよいでしょうか？ また、TCRがdownregulateした状態でもTCRをcloningするようなPCRとかはひっかかるものでしょうか？例えば、TCRのtypingを少ししてclonalityがどうかを見てみてもとは思ったりしています。 また、Exhaustionしていたとして、そこからpeptide-pulseしたDCと共培養するとTCRは戻ってくるものでしょうか？ 質問ばかりで申し訳ありません。 どうぞ宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3586-2 - 2014/11/26 (水) 11:23:14 - Tcellmaster exhaustedしてしまっているのかもしれませんね。 TcRのdown regulationはしばしばあります。 peptideをパルスしたDCと共培養してもだめでしょうか。

T cell cloning 削除/引用 No.3586-1 - 2014/11/26 (水) 10:57:35 - 東京大学院生 T細胞のcloningで問題が生じておりまして、アドバイス頂きたく記載させていただきます。 あるウイルス抗原由来ペプチド特異的T細胞をペプチド刺激後のCD137陽性細胞の集団でほぼ100%のpurityで単離してきまして、そちらをsingle cell毎にplateでirradiated PBMCにIL2とOKT3を加えてculture。2〜3週に一回feederを再度入れ替え、ということでしばらくT細胞が増えてきていた状況です。T細胞がpureであることはCD3、CD8などで確認できております。 そこで特異性を再確認するのに元々刺激したペプチドを加えても全くサイトカインが産生されません。また、同一のペプチドが乗ったtetramerで染めても全く染まりません。 考えられるのは、何らかのコンタミしたT細胞が増えてしまい、cloneでなくなってしまっている、というのが第一かと思っていますが、その他に何か原因というのは考えられますでしょうか？ 実際問題最近ではT細胞受容体の方をクローニングしてきてそれを導入して、その細胞の機能をチェックしている先生の方が多いのかもしれませんが、上司がまずcloningして各々のT細胞の機能をチェックしようという方針です。 どうぞ宜しくお願いいたします。

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