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(無題) 削除/引用 No.3583-16 - 2014/11/26 (水) 13:45:35 - 中西部ポスドク 以前Lipofectamin3000のフリーサンプルキャンペーンがあったのですが、どこかの会社からサンプルをもらって試してみるか、リバーストランスフェクションで細胞を播くと同時に（PEIの経験はないのですが）トランスフェクションしてみるとかでしょうか。リバーストランスフェクションは細胞株によっては大分効率が上がります。

(無題) 削除/引用 No.3583-15 - 2014/11/25 (火) 17:17:58 - おお 蛋白乗せすぎるとえいどうが乱れますね。

(無題) 削除/引用 No.3583-14 - 2014/11/25 (火) 15:10:29 - 独り言 すべての細胞を濃縮して、ウエスタンに使用するのは無謀すぎます。なんでも増やせばいいというものではなく、タンパク質が多すぎるとすべてのバンドがスメアーもしくは形のハッキリしないバンドとなりより検出が難しくなります。20ugが適量と言われていますが、個人的には10ugの方が見えやすいと思います。 手軽にアプライ量を増やすには、超遠心(100000rpmぐらい)でリボソームをペレットにして捨てれば、タンパク質量が2-3倍減るので、結果として2-3倍量をアプライできます。でもHisをプルダウンして10ulぐらいで要出すれば、1well分すべての目的タンパク質をアプライできるので、一番確実でしょう。 あとは、抗体のバックが少ないのであれば、ブロットに使用する抗体量（１次も２次も）増やせる余地はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3583-13 - 2014/11/25 (火) 15:09:53 - おお >[Re:9] トランスFOMAさんは書きました : > おお様 > タンパク質はERおよびゴルジに局在するタンパク質です。そのタンパク質に対する特異的なmAbがあるのですが、内在性のものは検出できないほど、少ないようです。過剰発現でようやくWBで検出できるようです。 ゴルジの膜についているか、膜を貫通しているなら、膜蛋白だけを回収すれば相当濃縮できるはずですが。。。 hypotonicなbufferなどで細胞をはれつさせておいて、核を除き、さらに30000gぐらいで遠心すれば膜をもった核以外の細胞小器官は回収できるはず。30000gがむりなら、microtube用の遠心機でmaxで長めにえんしんすればかなり回収できます(だいたい16000gぐらいになるとおもいますが)。 とくに膜に貫通しているような蛋白でしたら、Mem-PERのようなキットもうっています。 http://www.piercenet.com/product/mem-per-plus-membrane-protein-extraction-kit ただし切れた部分がどうなるかですね。きれてV5などで引っかかる部分が可溶画ぶんにくるなら、特異的抗体で反対側の切れ端を見ないといけない。 まあNiレジンプルダウンでV5か特異的抗体による検出は簡単に濃縮できますけどね。ちゃんとワークすれば。 > > ECLはpierceのpico detection kitを使用して、それをfilmに焼き付けています。long eposureでも検出はHEKではできるのですが、目的のCHOではできませんでした。 Pierceのpicoグレードは第一世代のECLなのでそれほど感度はよくありません。もちろんそれで十分な場合も多々ありますけど。 その次の世代でかなり検出感度があがりましたECL plus グレードのものを試してみるのもいいかと思います。サンプルをとりあえず取り寄せてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3583-12 - 2014/11/25 (火) 14:34:33 - トランスFOMA コストがかからずすぐに出来るTCA/アセトンはオススメではないようですね… 6-well dishの1 wellを全てwellにapplyできれば何か出るのではと期待しているのですが。。 50x10E4個の細胞で遺伝指導入後、2日待ってから回収しています。TCA/acetoneではoverloadになるでしょうか…

(無題) 削除/引用 No.3583-11 - 2014/11/25 (火) 14:33:05 - MP IRES GFPを発現するプラスミドに載せ替えてsortingで細胞を濃縮する。 sortingが無理であれば、IRES H2K もしくは IRES CD4などに載せ替えて、MACSで濃縮という手もありかも。いずれも載せ替えのステップとコストが余計にかかりますが。

(無題) 削除/引用 No.3583-10 - 2014/11/25 (火) 14:32:22 - トランスFOMA GT様 導入方法はPEIを使用しています。経済的な余裕がなく、それもいただいたPEIで導入しています。 このCHO変異体を供与してくださったラボはliporectamine2000+Plusを用いていました。 CHO変異体への導入効率はPEIの場合、いいときで30%ほどです。ウイルスはボスが嫌うためできそうにありません。ありがとうございます。 おお様 Calpainというプロテアーゼによりある基質が切断されることを証明したいのです。その基質 (V5-Hisx6 tag付き) の切断を見たいため、どうしてもWBで行えればと思っています。 また、CHO変異体のlysateを抗Hisx6抗体でブロットすると非常に強いバンドが3本見えますが、幸い、full lengthおよび切断後のフラグメントにはかかりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3583-9 - 2014/11/25 (火) 14:27:58 - トランスFOMA おお様 タンパク質はERおよびゴルジに局在するタンパク質です。そのタンパク質に対する特異的なmAbがあるのですが、内在性のものは検出できないほど、少ないようです。過剰発現でようやくWBで検出できるようです。 ECLはpierceのpico detection kitを使用して、それをfilmに焼き付けています。long eposureでも検出はHEKではできるのですが、目的のCHOではできませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3583-8 - 2014/11/25 (火) 14:25:01 - トランスFOMA ~様、TS様 免沈がまず始めにトライすべき手段との認識を今理解しました。 ただ、正直NiビーズやV5抗体は今手元に無く、貴重な抗Hisx6抗体のみです。 隣りのラボから一時的にNiビーズを借りることも考えて行こうと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3583-7 - 2014/11/25 (火) 14:03:08 - おお 6xHisでおとして、Hisの抗体で検出すると、いろいろなものが検出されそうですが、V5の抗体はおもちですよね。6xHisの抗体はよほど発現が強くないと、そのままWBでは厳しいかもしれない。Hisが並んでる蛋白はマンマルなどではけっこう見つかるのもてつだってか、バックをおとすと検出できず、感度をあげるといろんな蛋白が引っかかり、目的のバンドが見れないとか。

(無題) 削除/引用 No.3583-6 - 2014/11/25 (火) 13:57:54 - おお あとは絶対にWBでないといけませんか?免疫染色はどうだろう。場合によってはELISAも。

(無題) 削除/引用 No.3583-5 - 2014/11/25 (火) 12:21:39 - GT 導入方法は何を使っていますか？ ベクターの導入方法も議論してもらうとよいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3583-4 - 2014/11/25 (火) 11:27:40 - おお IPか、Ni beads pull-downがまずは検出を考えているのならやってみる手はあるとおもいます。 あとは細胞質で発現しているなら、核蛋白がほとんど抽出されない方法、核蛋白なら細胞質を除いてから抽出、膜蛋白なら、膜フラクションだけを回収するとロードする量はふえます。 あとはECL検出きっとで10倍ぐらい検出感度が変わったりしますね。CCDカメラで検出しているなら、フィルムで何とか引っかかる程度のものは検出できないかも(最近はかんどあがってきてるようですが)。なのでカメラでやっているなら、フィルムで焼いてみてもいいかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3583-3 - 2014/11/25 (火) 08:54:09 - TS 免沈は不可ですか?　Anti-Hisで。目的次第かもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3583-2 - 2014/11/25 (火) 08:53:45 - ~ 2~3倍乗せて長焼きしてもダメであれば、 次の選択肢としては免疫沈降による濃縮が現実的だと思います。 Overloadのリスクは減りますし、ヒスタグであればキットがありますので、 ある程度は安定した結果が期待できます。 ただ、キットが手元にないのであれば、発注している間に同時並行で acetone/TCAでの濃縮も試してみてはいかがでしょうか。

遺伝子導入効率が悪い時の対処法 削除/引用 No.3583-1 - 2014/11/25 (火) 07:49:45 - トランスFOMA CHOの変異体に遺伝子を一過性に導入していますが、このmutantのせいなのか10%ほどしか導入されていないようです。導入効率はGFP発現ベクターで検討しています。今リバイス中で、これからウイルス作製やDNA組替え申請手続きを踏む時間がありません。どうにかしてこのタンパク質を検出したいです。導入タンパク質はC末にV5-Hisx6が付いています。HEK293に発現させるときちんと抗His抗体で検出されます。 western blottingでの検出を試みていますが、loadingの量を増やす以外に、どのような方法が現実的でしょうか？loadingの量はせいぜい2-3倍しか増えません。たとえばNi-ビーズでlysateからHistagタンパク質を濃縮してそれをアプライする方法。acetone/TCAで沈殿させたものをアプライする方法など考えてみましたが、おすすめがありましたら教えてください。 acetone/TCAは経験があるのですが、SDS-PAGEの1laneあたりの総タンパク質量がover-loadとなってしまう可能性もあるかと思います。スケールは6-well dishの1 wellが一つのサンプルです。

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