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(無題) 削除/引用 No.3577-20 - 2014/11/23 (日) 04:29:51 - yyy episomeを持ってるとか、コンピたんとセル側の問題なら種類を変えれば解決しそうですね。 ただ、SalIだと8kbpが無くて、代わりに6kと2kと言うことは、SalIサイトは目的のPlasmidではuniqueでは無さそうで、その参照した配列の信頼性に疑問が出てくるような気がしますが。 配列は添付のブックレットにでもあったのでしょうか？それともAddgeneとかで調べたのでしょうかね？

(無題) 削除/引用 No.3577-19 - 2014/11/23 (日) 04:02:16 - おお EcoRIはhigh bufferでも切れるんだけど、最適なコンディションでもなさそうで、専用bufferを提供しているメーカーもあるとおもう。また最近はスター活性をふくめ、ノンスペシフィックな切断が少ない酵素も出てるようです。そういうのはhigh fidelity (HF)が商品名についているとおもう。でもたいていは酵素の入れすぎ、長時間の処理に気を付ければ大丈夫だと思う。 ちなみにhigh concentrationのものも出回っているけど、そう言うの使うと大過剰に入れ気味になると思う。1ulで1000 units ぐらいになっちゃうんじゃないかな。なので酵素のunitも意識した方がいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.3577-18 - 2014/11/23 (日) 02:21:46 - おお あと、切ってないコントロール(できれば酵素抜きバッファーあり、incubationする必要はないかも)を同時に流してください。かんぜんにcutされず環状のDNAは直鎖状の位置より上に出たり、下に出たりしますから。

(無題) 削除/引用 No.3577-17 - 2014/11/23 (日) 02:13:03 - おお なんかepisomeをもってませんかその大腸菌。

(無題) 削除/引用 No.3577-16 - 2014/11/22 (土) 20:28:56 - mon >[Re:15] MONOさんは書きました : > 経験から、Star活性はスメアになりバンドが見えなくなると思っていますが > 別のところにバンドが出ることもあるのでしょうか？ スメアになるのはよっぽど酷い反応条件で認識部位がかなり甘くなっているのでは。 大抵は（？）6塩基認識が4塩基認識になるくらいなのでバンドはでると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3577-15 - 2014/11/22 (土) 20:08:28 - MONO mon様 きれいなまとめ、大変恐縮です。 ありがとうございます！ 経験から、Star活性はスメアになりバンドが見えなくなると思っていますが 別のところにバンドが出ることもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3577-14 - 2014/11/22 (土) 19:56:12 - mon 整理しますと、 (1)目的のplasmidのサイズは8kbで、配列はわかっている（つもりである）。 (2それによると、EcoRI,SalI,AgeI,NruI,SmaIの認識部位はそれぞれ１カ所である。 (3)AgeI,NruI,SmaIで切断すると8kbのバンドのみ観察された。 −＞完全消化できて、予想通り。 しかし、 (4)SalIで切断すると8kbのバンドはなく、6kb,2kbのバンドが観察された。 ー＞各バンドの濃さから想定すると、完全消化＝予想配列が間違っている(SalI認識部位は２箇所）。 (5)EcoRIで切断すると8 kb、8kbのすぐ下、4 kbおよび2 kbのバンドが観察された。 ー＞各バンドの濃さから推定すると、予想配列が間違っていて、かつ不完全消化（酵素の部分失活）。 あるいはスター活性（酵素の入れすぎ？）で本体の認識部位以外での切断が生じている。 こんなところかな？

(無題) 削除/引用 No.3577-13 - 2014/11/22 (土) 19:09:40 - MONO 皆様 お返事ありがとうございます。 私の説明が大変下手で申し訳有りません。 一つの文章を短く書いて見ます。 前回書いていなかったのですがゲノムDNAはコンタミしていると思います。 なぜならば20kbのところにバンドが現れているからです。 onecutで予想されるバンドは8 kbです。 onecutの制限酵素として用いたSalI（H buffer)です。 ゲノムDNAのバンドの他に、6 kbと2 kbに現れました。 2 kbのバンドが6 kbの1/3ほどの濃さです。 別のone cutの制限酵素として用いたEcoRI(H　buffer）では、 ゲノムDNAのバンド、目的の8 kb、8kbのすぐ下、4 kbおよび2 kbのところにバンドが現れました。全部で5本バンドが出ています。 バンドの濃さは8kbがもっとも濃いです。 8kbのすぐ下と4kbのバンドは、8kbのバンドの1/4くらいの濃さです。 2 kbのバンドは8kbのバンドの1/8くらいの濃さです。 他のonecutの制限酵素であるAgeI（NEB smart buffer),NruI（NruI buffer), SmaI(T buffer)を用いました。 ゲノムDNAのバンドの他に、目的の8kbにのみバンドが現れました。 フェノクロはPlasmidのほうに行っています。バッファーではありません。 目的ではないバンドが大腸菌のゲノムDNA由来であるとすると、 AgeIなど他のonecutの制限酵素でバンドが見えないのは何ででしょうか。 これは制限酵素によるとしか言えないのでしょうか・・・。

(無題) 削除/引用 No.3577-12 - 2014/11/22 (土) 17:52:01 - おお pcnBはpoly(A) polymerase I をコードするようですが、直接的にはゲノムのメチレーションにはかかわってませんね。 そう言う特殊な株についてはそれを昔から使っているラボから情報を得た方がいいような気がします(たまたま扱っている人がここを見てコメントを残してくれるかもしれませんけど)。 菌株できれる、きれなくなるという話なら、制限酵素が何かぐらいの情報がないと、何の話も展開ができないとおもいます。 ただ今回の場合はそこまで難しい話ではないような気がしますけどね。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3561954/

(無題) 削除/引用 No.3577-11 - 2014/11/22 (土) 11:46:06 - だいたい この手の質問者はレスもらってもだんまり決めるよね。

(無題) 削除/引用 No.3577-10 - 2014/11/22 (土) 10:47:26 - し バッファーをフェノクロしてたら目を疑いますね・・・。

(無題) 削除/引用 No.3577-9 - 2014/11/22 (土) 08:56:46 - おお まあbufferだったらとんでもないなとはおもってましたけど、、、

(無題) 削除/引用 No.3577-8 - 2014/11/22 (土) 08:37:36 - おお >[Re:7] しさんは書きました : > おおさん > > バッファーのフェノクロでは流石にない気がしますけど。 > 精製したDNA中のDNaseコンタミを疑ったのでは？ >H Bufferで反応するDNaseのコンタミかと思いフェノール・クロロホルムでタンパク質を除去し、 てかいてましたのでbufferをフェノクロしたのかと、、、DNAの方をフェノクロしたとするならば、bufferのチューブ間での違いにたいして解決方法になってるのかな、、、まよくわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3577-7 - 2014/11/22 (土) 07:26:06 - し おおさん バッファーのフェノクロでは流石にない気がしますけど。 精製したDNA中のDNaseコンタミを疑ったのでは？

(無題) 削除/引用 No.3577-6 - 2014/11/22 (土) 01:42:31 - だいたい 実験がうまくいかないのと、説明がうまく出来ないのは比例関係にある希ガス

(無題) 削除/引用 No.3577-5 - 2014/11/22 (土) 01:36:58 - おお DNaseのコンタミなら制限酵素なし、バッファーありでわかるはず(バッファーなしコントロールを忘れずに)。 バッファーのフェノクロはなんかバッファー成分が抜けたり濃度が変わったりしそうで(DTTとか、BSAがはいったやつもあるよね)、、、 そもそも怪しいバッファーはつかわず、信用できるものだけのこしてすてればいいかと。

(無題) 削除/引用 No.3577-4 - 2014/11/22 (土) 01:27:01 - おお バッファーよりプラスミド自身の何らかの原因で切れにくくなっているか、酵素がへたってるとおもいますが。それかスター活性か、、、

(無題) 削除/引用 No.3577-3 - 2014/11/22 (土) 00:13:51 - yyy 一つの制限酵素を別々のバッファーで試したのか 至適バッファーが異なる別々のone cutのはずの酵素で切ったのか そこが曖昧なのですが、どうなんでしょう？ 後者だとしたら、ゲノムDNAか別のプラスミドのコンタミの可能性が高いような気がしますが。 あるいは、思いっきり初歩的ですが、one cutの酵素に別の制限酵素のコンタミ、とか

(無題) 削除/引用 No.3577-2 - 2014/11/21 (金) 19:34:58 - 774R バンドのサイズ、それぞれのバンドの濃淡（比率）、シャープさなどが分かれば、コメント出来るかもしれないけれど、これだと情報が少なすぎてなんとも・・・。 写真があればベストだけど、予想サイズと出たバンドのサイズくらいは書けますよね？ 使った制限酵素の種類も必要な情報になるかもしれない。

制限酵素のバッファーによってプラスミドの切れ方が変わる 削除/引用 No.3577-1 - 2014/11/21 (金) 19:26:04 - MONO 皆様お世話になっております。 どうか皆様の知恵をお貸しください。 現在クローニングを行っているのですが、 大腸菌で増幅させたプラスミドを one cutの制限酵素(H Buffer)で切断するとバンドが 複数本出てきてしまいます。 別のH Bufferを用いるone cutの制限酵素でも複数バンドが現れました。 しかし、別のbufferを用いるone cutの制限酵素ではきれいに一本のバンドが見えました。 H Bufferで反応するDNaseのコンタミかと思いフェノール・クロロホルムでタンパク質を除去し、 プロメガの精製キットで精製して制限酵素反応を試みましたが、 H Bufferの制限酵素では複数バンドが現れました。 増幅に用いている大腸菌がΔpcnBなのですが（KEIOクローン） 増幅させる大腸菌によってバッファーへのsensitivity？は変わるのでしょうか？ これからDH5αで増幅させたプラスミドとも比較するのですが、 その実験を行う前に皆様の考えをお聞きしたくて投稿させていただきました。 似たような経験された方や、なにかお考えがある方がいらっしゃいましたら、 ぜひともお力をお貸しください。 よろしくお願いいたします。

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