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(無題) 削除/引用 No.3576-11 - 2014/11/26 (水) 10:14:17 - 経験者 ｘ５０００で使用すべき。 一回やってみ

(無題) 削除/引用 No.3576-10 - 2014/11/26 (水) 03:14:55 - yyy 私もcell signalingの抗体はカタログの濃度よりもかなり薄めて使ってます。 Trial sizeの抗体を買っても再利用したりすれば、かなり持つんですよね。 個人的には信頼性の高い会社の一つだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3576-9 - 2014/11/25 (火) 22:58:56 - まっくろん すでに解決してるかもしれませんが、明らかにできる範囲で標的や 具体的な手法を記載されると、よりコメントがつきやすいかと思います。当方ではAnti-rabbitとmouseでCST二次抗体を使っていますが、alphaさんと同じく推奨濃度のよりさらに下げても綺麗に検出できる印象です。

(無題) 削除/引用 No.3576-8 - 2014/11/25 (火) 21:53:34 - ご検討を ブロッキング不足の可能性もありますし、ブロッキングに使ったタンパクに反応してしまっている可能性はありませんか？ たとえば、抗チロシンリン酸化抗体で検出するときに、ミルクでブロッキングすると、ミルクにはリン酸化チロシンが多量に含まれているのでメンブレンが真っ黒になる・・・ということがわかっています。

(無題) 削除/引用 No.3576-7 - 2014/11/25 (火) 15:31:25 - rara みなさんご意見ありがとうございます。 まずはブロッキングをしっかりした後、二次抗体の希釈倍率を下げて、洗浄も十分にして検出してみます。 まだまだ新米なので、大変参考になりました。 ありがとうございました。

お疲れ様です 削除/引用 No.3576-6 - 2014/11/22 (土) 08:09:41 - 尾も白い お疲れさまです。 発色基質によると思います。 私はThermoのWestFemtoを使用していますが、抗体の濃度の１次抗体 ２次抗体のrangeを書いてくれています。ちなみにCSTの抗体は濃度が書いていないのでLotごとちがうためか会社にメールで聞くようになっています。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3576-5 - 2014/11/22 (土) 05:07:50 - おお CSTはつかってませんが、一般論として、 >また、二次抗体の希釈駅は、ブロッキング液か、増強剤（canget signal）かどちらが良いでしょうか？ どっちでもいいでしょう。もちろんほかの方がしてきしているようにTBST/PBSTでもいいかとおもいますが、最近ディテクションシステムの感度が向上していますので、、、じっさいTBST/PBSTでやってバックが出た人が身近にいます。抗体量、incubation時間、washの条件にもよるでしょう。 CST以外でいろいろ2次抗体を使ってますが、ECL plus以降のケミルミのシステムではどれをとっても10000倍ぐらいで十分です。まあECLグレードでも抗体がよくて発現量がよほど低くないなら8000-10000倍でじゅうぶんです。 一次抗体がブロッキング不足でメンブレン全体についてしまっている可能性もあるので、まずはブロッキングをしっかり行うことが肝心かと思います。

(無題) 削除/引用 No.3576-4 - 2014/11/22 (土) 03:09:06 - せるし うちでもCSTの二次抗体をルーチンで使っております。（ウサギですから赤いキャップですか？）うちでは標準で1/2000希釈、5パーミルクで1時間室温インキュベートです。洗いは15分3回しています。以前早く結果を見たくて5分3回にしたらバックが高かったので急がば回れで15分3回に戻しました。アクチンチュブリンなどのコントロールに対してでしたらもう少し下げてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3576-3 - 2014/11/21 (金) 21:13:09 - alpha ブロッキング・洗浄が不十分だとバックが強くなる印象があります。 二次抗体が1:1000はかなり濃いと思います。 解析方法が異なるので、一概に適しているかどうかは断言できませんが、CSTの抗体は感覚的にデータシートに記載されている濃度以上に薄めても容易に検出できる印象です。 サンプルにもよるので、こちらも断言できませんが…

(無題) 削除/引用 No.3576-2 - 2014/11/21 (金) 18:55:49 - 後退 ・2次抗体の希釈倍率を上げる。 ・1次抗体無しで2次抗体のみでどうなるか確認。原因の切り分け。 ・最初のブロッキングをしっかりやる。 ストリッピングの有無はバックグラウンドと関係ないと思います。 2次抗体はブロッキング液で良い。そこで増強する必要ないので。 極端な話、ブロッキング済みなのでTTBSで2次抗体を希釈して使っても大丈夫。

CSTの二次抗体 削除/引用 No.3576-1 - 2014/11/21 (金) 18:43:05 - rara 現在ウェスタンブロットを行っています。 一次抗体1000倍希釈、二次抗体1000倍希釈でした。 バックグラウンドが真っ黒で、指導員の方とディスカッションしたところ、二次抗体が濃すぎるかもしれないとのことでした。 新しい（ストリッピングしてない）メンブレンだったので、確かにバックにも反応してしまったのかなと。 そこで、次回はストリッピングし、二次抗体の希釈を5000〜10000倍くらいにしてみようと思っています。 二次抗体はCSTのanti rabbit Abを使用（推奨：1000倍希釈）です。 CSTの二次抗体を使用経験のある方で、二次抗体の希釈はどのくらいにしていたでしょうか？ また、二次抗体の希釈駅は、ブロッキング液か、増強剤（canget signal）かどちらが良いでしょうか？

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