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(無題) 削除/引用 No.3571-5 - 2014/11/20 (木) 15:26:36 - cDNA Deletion mutantであっても点変異であっても、私はinverse PCRを好んで使っています。Quickchangeで失敗したことが多いからなのと、増幅反応後、Quickchangeだと電気泳動で見えないので、増幅反応自体がうまく行っていないか分からないまま形質転換して、どこに問題があったのか分かりにくいため、トラブルシュートが難しい印象です。Inverse PCRだと増幅に問題が無ければほとんどの場合、欲しいクローンが取れると感じています。 QuickchangeでDeletion出来るのは、ポリメラーゼが二本鎖になっているところを越えられないから、だと理解しています。よく鋳型がループになっている絵を見ますが、そうではなくて、プライマーは2か所に結合して途中で止まるのだと考えた方がしっくりきます。そのためには結合が確実な方が良くて、Tmを高めにするか、アニーリング温度を下げるか、などが効果的かもしれないと想像します。 個人的にはInverse PCRをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.3571-4 - 2014/11/20 (木) 08:44:14 - asan どこまでがQuickChangeのシステムと認識されているのかは正直論文や人によっても曖昧なんですが、正直この方法と類似したやりかた（原理的にはおそらく重複する部分がかなりある）で多くの論文がdeletionの作製方法を論じていたりします。 結局はっきりとしたことはよくわかりませんが、このQuickChangeに類似したシステムは1. PCRではなくてlinear-amplificationであるということ、2.”のりしろ”のように作用するといっているのはdeletion 部位をまたいでのりになるのではなくて、あくまで増幅した後の末端の15-20bps程度の相同領域による”セルフアニーリング”によるものの可能性が高い。3. 大腸菌内の修復機構によって飛び出た部分やニック、あるいは部分的に欠損した領域は修復される。 という3点のメカニズムが本質的にはあるように思えます。ただ、最近の一部の論文ではPCR自体の不十分な伸長反応産物が多く存在することからそれによって相同的な突出末端がかなりの割合でできているということも言われてます。この辺のメカニズムは結構曖昧なんですが、要するにわれわれが思っている以上に15塩基程度の相同性のある領域というのは室温かそれ以下では親和性が高く、かなりの効率で勝手にアニーリングするわけです。制限酵素の場合4-6塩基程度と短いためligaseをつかったligationであり、これはアニーリングというのが決定的な効率の違いを生むわけです。 というわけで話はずれましたが、結論から言うと1000塩基程度ならしっかり増幅が見えれば問題なくつくれます。個人的な見解としてはこの手の方法は原理的にはそれ以上も十分可能です（あくまで相補性の高い末端がセルフアニーリングするだけなので。） ちなみに設計のポイントは5'側15-20bps程度が重なるようにdeletion部位で”完全に”相補的にしないようにして（重要）、特に何も考えずに30〜40bps程度までにできるだけ抑えて設計すればOKです。primerが長すぎると逆にうまくいかない気がしますが、おそらく構造上ヘアピンのような形になる場合があるのかなあと思います。Quick change のTm 云々は完全に無視です。 さらに言えば、片方は鋳型に完全に相補的にしてもう片方のprimerの5'のみをその部分に相補的になるように15ベースぐらいとって3'側の場所を変えたようなプライマーを何個も設計すれば、それぞれの長さの欠損対がとれることも確認しています。このことからも単なる末端同士のアニーリングという考えはあながち間違っていないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3571-3 - 2014/11/20 (木) 05:42:19 - yyy すみませんが、QuickChangeと言うのは単なる商標名だとしか理解していません。QuickChange kitを使う場合も、個人的にはdeletion mutationを作る時はいわゆるinverse PCR以外は使ったことがありませんが、それ以外でdeletion mutationを作る方法というのは具体的にどんなものなのでしょうか？ その辺を書いたほうがレスが付きやすいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3571-2 - 2014/11/20 (木) 04:09:34 - yui 以下を読むと http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/upload/upld71/qa/stratagene71qa01.pdf **************************************************** 導入できた最も大きな欠失変異のサイズはどのくらいか? 各商品について、以下のような実績がございます。 QuikChange® XL:5.6Kbのプラスミドで318bpの欠失 (外部データ) QuikChange®:5.6Kbのプラスミドで84bpの欠失 (外部データ) **************************************************** これを読むととてもquickchange mutagenesisで1200 bpの欠失は無理そうですね。。 現に、今上手く行ってないので、inverse PCRで行った方が早いでしょうか… 今朝再度quickchange mutagenesisを行ってDpn1処理した前回のサンプルに、再度Dpn1を2倍多く加えて、37度, 1hr処理しましたが、はやり沢山のコロニーがプレート一面に生えてしまいました。 このDpn1で三週間ほど前に3つのmutagenesisをしたので、酵素の問題ではないとおもうのですが。 今deletionした領域にHpa1サイトがあることがわかったので、再度buffer 4中でDpn1+Hpa1処理して形質転換しようと思いますが、これでだめならinverse PCRでしょうか？

quickchange mutagenesisで欠失変異体 削除/引用 No.3571-1 - 2014/11/19 (水) 15:03:04 - yui 初めて欠失変異体を作製しようと計画していますが、ご意見を伺いたくトピックを立てました。よろしくお願いします。 興味あるタンパク質は全長1100アミノ酸で大きめです。先行研究ではこの全長のタンパク質のほ乳類細胞への発現効率は低く、400アミノ酸ほど欠失した変異体で実験を行っていることが多いようです。そこで私もその欠失変異体を作製したいです。 inverse PCRの原理で欠失したい領域から外向きにPCRをかける方法の他に、quickchange mutagenesisで欠失変異体を作製するというのもあるようです。 Stratageneのquickchange mutagenesisのホームページに行くと、欠失させたい領域を指定すれば自動的に購入すべきプライマーが表示されますので、それで現在行っているところです。 今のところ結果はDpn1の消化不良なのかものすごいコロニーが一面に生えてしまっている状況です。。 質問はそれとは別なのですが、過去のbiotechnical forumの書き込みを読んでいるとdeletionできる長さに限界があるような書き込みが散見されました。それを読んで以降、inverse PCRの方が良かったのではと思わずにはいられません。このstratageneのquick change mutagenesisで1200塩基ほど欠失させることは無理無いことでしょうか？初めてなのでよくわかりません。経験に基づいたご意見が伺いたく思い、質問しました。どうぞよろしくお願いします。

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