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(無題) 削除/引用 No.3551-8 - 2014/11/17 (月) 08:43:16 - み 確かに非特異性的な抗体の反応を真っ先に考えるけどね。 強制発現でも起こるなどで確かめれば良い。 ノックダウンもね。

(無題) 削除/引用 No.3551-7 - 2014/11/17 (月) 08:31:45 - tt 抗体の非特異的な認識を疑わないのはなぜだろう

(無題) 削除/引用 No.3551-6 - 2014/11/16 (日) 18:01:57 - おお そもそも生理的条件下でダイマーになっていることに示唆的な事実があるんでしょうか。ほかの蛋白でダイマー関与するドメインがその蛋白にもあるとか、パラログやオーソログで構造がわかっているとか。。。まあそう言うのがないならダイマーじゃないとまでいいませんけど。 高分子にあるそのバンドが尿素やDTTでなくなったからといってそくダイマーという話でもないでしょうから、どこまで解決策になっているか、、、 ダイマーに関与する配列があるなら、そこをつぶした配列を発現ベクターにいれて発現させると高い方にこないとか、違うタグがついた発現ベクターを同時に発現させて、sample bufferに近い条件で変性して、SDSが0.1%以下になるように1%NP40などのバッファーで希釈して一方のタグでIPして、IPフラクションをもう一方のタグでWBするとか、 そういうことをしないと、尿素で解離したねぇー...でおわってしまわないかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.3551-5 - 2014/11/16 (日) 17:31:57 - 初心者 皆様ありがとうございます。 まずは還元剤をメルカプトからDTTに変えてみて、 熱処理の有無で条件検討をしてみます。 メルカプトよりDTTの方が還元力が強いとされているようですし。 それでも駄目ならば尿素や長時間放置を試してみます。 ２、３日で結果が出ると思うので出ましたらまたご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3551-4 - 2014/11/16 (日) 17:05:15 - 名無し それが仮にnon-covalent and SDS-resistantなホモダイマーだったとして（たしかにそういう変なのはたまにある）という前提での話だが、SDS-sample buffer (bME+)あるいは8MUrea入りSDS-sample buffer（bME+)中（いずれも加熱処理はしない）で１晩室温放置してみたら解離するかも。多少なりとも解離する傾向がみられれば時間を２日〜３日まで延長してみるといい。 どうやっても解離しないならば、やっぱ別の可能性も想定した方がいい。スプライシングバリアント、トランスグルタミナーゼによる分子間架橋、糖鎖修飾、ubiquitinとかその親戚筋の蛋白質による修飾、構成するアミノ酸の偏り等に起因するゲル内易働度の遅延（等電点が極端に塩基性or 酸性ということはないかな）、とかいろいろある。その蛋白質に関する過去の論文とかに出てるウェスタンのデータとかではどんな感じなのかな。もしそういうかんじなら、何かそれらしい説明が書いてある気がするんだが。

(無題) 削除/引用 No.3551-3 - 2014/11/16 (日) 02:00:31 - おお ダイマーの可能性もないことはないと思いますが、SDSPAGEでダイマーが見れることはほとんどありません。本当かなぁという気もしますが、もしダイマーなら、 コバレントでないばあい。疎水性が強いと離れない場合があります。そう言う場合は結合していた近くの分子とのアグリゲーションの可能性がありますが、外す、またはそれが起こらないようにするなら、sample bufferで熱処理をなるべくしない。処理後尿素で疎水的相互作用をほどく。 特殊な状況下でS-S結合が2-meで外れにくくなっているばあいはDTTなどを添加してみてもいいかもしれません。 コバレントな結合は上記のような処理では外れません。やれることで思いつくのはなるべくきれいに生成してマススペックにかけて、ペプチドが架橋されている部分をみつけるとかでしょうか。 あとサイズが2倍近くだからdimerとおもえるかもしれませんが、もっとほかの可能性も考える必要性があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3551-2 - 2014/11/15 (土) 20:29:37 - み ｻﾝﾌﾟﾙﾊﾞｯﾌｧｰに8M urea入れてみては。

WBでのダイマー形成 削除/引用 No.3551-1 - 2014/11/15 (土) 19:10:39 - 初心者 いつもお世話になっております。 あるタンパクをWBで検出すると、いつも2本のバンドが出ます。 みかけの分子量がおおよそ倍なので、非特異というよりダイマーの可能性を疑っています。 laemmli+メルカプトで直接細胞を溶解し、熱処理を３分ほどかけてから泳動していますが、 なにかダイマーをほどく手法をご存知の方がいらっしゃればご教示ください。 お願いいたします。

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