Bio Technical フォーラム

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No.3544-5 - 2014/11/13 (木) 23:48:14 - CCR
サンショウウオさん

コメントありがとうございます。教えて頂いたサイトを見ると、７回膜貫通型受容体がオリゴマーになってしまうのは、疎水結合によると理解してよいのでしょうか？　この場合、ランダムにオリゴマー（分子数が様々なオリゴマーで、他のタンパクも巻き込んだヘテロマー）になるからスメアーになるという事でしょうか？　私の実験で一つ疑問なのは、bMEを加えて4oCでSDS化した場合、スメアーにならず80kDaと150kDaに比較的きれいなバンドが出る事で、ランダムなオリゴマーのような感じがあまりしないんですよね。どこをどう改善したらいいのか、ちょっと途方に暮れています。疎水結合によるオリゴマーだった場合、4oCでSDS化する以外に、何かアイデアがありますでしょうか？

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No.3544-4 - 2014/11/13 (木) 22:56:33 - サンショウウオ
http://www.researchgate.net/post/Using_Western_Blotting_can_anyone_give_me_advice_on_the_conditions_for_probing_GPCRs

私も似たような現象に遭遇したことがありまして、膜タンパク質をボイルして225kDaいじょうのスメア、もしくは単一バンドになったことがあります。


上記フォーラム見てから、ボイルなし、出来る限りライセートを氷上であつかうなどしてなんとかモノマーのバンドが検出できました。(95%以上がスメアで、5%程度のうっすらとしたモノマーのバンド。感度はマーカーが滲むぐらいの限界の感度。)。
バンドは予想より10kDaほどちいさくでましたけどね。。。

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No.3544-3 - 2014/11/13 (木) 22:36:34 - CCR
774Rさん

コメントありがとうございます。既報の論文をみると、タグ付きで細胞株に過剰発現した場合、そのタグに対するウエスタンで40kDaあたりに検出できるようです。細胞株を使って内在性タンパクをウエスタンで見た場合も、40kDaあたりに出るようですが、ほとんどがIPウエスタンでやっているようです。

モノマー？ 削除/引用
No.3544-2 - 2014/11/13 (木) 21:11:34 - 774R
モノマーの移動度が40kdaという保証はありますでしょうか？

糖鎖付加などで本来の分子量より上にバンドが出ることはよくありますので・・・

特に膜タンパク質や受容体では珍しくないと思います。

７回膜貫通型受容体のウエスタン解析 削除/引用
No.3544-1 - 2014/11/13 (木) 18:55:02 - CCR
７回膜貫通型のケモカイン受容体（40kDa）のマウス腫瘍組織での発現を、蛋白レベルで解析しています。免染ではそれらしい結果が得られているのですが、分離した細胞のsurface FACSでは検出不能でした。現在、この抗体でウエスタンを行っています。

最初は、腫瘍と脾臓（ポジコン）の組織を直接SDSバッファーに溶かし、bMEを入れてボイルしたサンプルを使ったのですが、腫瘍サンプルではバンドが検出されず、脾臓では250kDaよりも大きなところに強いバンドが見られました。過去ログでボイルによる蛋白凝集の可能性が指摘されているのを見て、今度は組織をRIPA（0.1%SDS/0.5%DOC/1%NP40）で溶かして、4xサンプルバッファーとbMEを入れて一晩4oCにおいたところ、脾臓で80kDaの強いバンドと150kDaあたりに弱いバンドが見られ、腫瘍サンプルでは150kDaの弱いバンドのみ見られましたが、 モノマー（40kDa）のバンドは見られませんでした。

この受容体のダイマー、オリゴマー形成の報告は多少あるのですが、検出されたバンドが非特異である可能性も十分あり、40kDaのバンドを何とか検出したいと思っています。 還元剤をDTTにしてみようと思うのですが、２点お伺いさせて下さい。

（１）すでにbMEとSDSが入っているサンプルに直接DTTを加えるのは、何か問題がありますでしょうか？
（２）仮にS-S結合によるオリゴマーだったとして、それをモノマーにするのに必要なDTTの濃度はどの程度でしょうか？
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