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(無題) 削除/引用 No.3544-25 - 2014/11/27 (木) 00:32:52 - CCR proteinさん コメントありがとうございます。 レスが付いているのを見落としており、返事が遅くなってすいません。この抗体の特異性がウエスタンで確認できたら、FACSに関しては固定透過して細胞内染色を試してみようと考えていたのですが、比較的発現量の低い受容体の場合、生細胞のまま 37oCで抗体と反応させれば、一時的に細胞表面にrecycleされてきた受容体も抗体で染める事ができ、検出感度が上がる可能性がありますね。本当に勉強になります。理にかなったアプローチだと思うので試してみます。最低限endosomeがplasma membraneに融合する過程をサポートできるバッファー（カルシウム入り？）あるいは培地内で抗体反応を進める必要がありそうですね。教えて頂いた掲示板に論文が出てるようなので、読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.3544-24 - 2014/11/24 (月) 23:38:56 - protein FACSの話ですが、chemokine receptorの染色はトリッキーで、 染色時の温度が影響したりするようです。https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2011-February/040771.html receptorのinternalize/recycleが関係しているようです。もちろん生細胞を染色している場合に限りますが。

(無題) 削除/引用 No.3544-23 - 2014/11/19 (水) 05:06:02 - CCR ポジコンの脾臓サンプルで尿素ゲル試してみました。尿素はmaxで10Mにしかならなかった（それ以上入れても室温では溶けませんでした）ので、サンプルとゲルの尿素濃度は最終で5Mとしました。大部分は依然として80kDaあたりに出ましたが、弱いバンドが40kDaに検出できました。尿素で一部乖離し得る40kDaのタンパクが80kDaのバンドに含まれていると判断しました。 尿素で何とかなる可能性が見えてきたので、再度サンプル調整からやり直そうと思っています。受容体の阻害剤があるので、24時間程度の前培養を阻害剤あるなしでやってから、RIPAで溶出し、尿素で変性した後、SDSサンプルバッファーとDTTを入れて、尿素ゲルでSDS-PAGEしてみようと思います。 皆様、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3544-22 - 2014/11/16 (日) 06:28:00 - CCR おおさん 大腸菌ではありませんが、HEK293で発現させて機能を保持したまま精製した論文が出てます。この場合はSDS-PAGEで40kDaに出るようです。この論文では機能保持に適したミセルのdetergentを探索しており、detergent存在下でのオリゴマー形成を調べてます。興味深いことに、detergentでオリゴマーになっているサンプルでも、SDS-PAGEでは40kDaに出るみたいなんですよね。残念ながらSDS化の過程は全くメソッドに記載されておらず、単に「SDS-PAGEした」としか書かれてないので、加熱や還元剤の条件は不明です。 yyyさん コメントありがとうございます。私も直感的にはTMドメインの糖鎖修飾は無いと思うのですが、根拠がないので自信がないです。これらのAsnはソフトウェア（NetNGlyc）では引っかかりますが、Uniprotではglycosylation siteとされてないようです。 サンショウウオさんのコメントに説得力を感じており、イメージとしては、受容体の細胞内ドメインにarrestinが結合した状態でSDSにさらされた時に、暴露された疎水性部分を介して巻き込まれるような感じです。もちろんホモダイマー、ホモオリゴマーの可能性もありますし、非特異バンドの可能性もあります。尿素で何とかならないか、試してみます。

(無題) 削除/引用 No.3544-21 - 2014/11/16 (日) 02:51:21 - yyy >[Re:19] CCRさんは書きました : > 一つ気になるのは、過去の論文のほとんどがIPで40kDaのモノマーを検出している事です。IP complexからeluteする際の方法を詳しく書いてある論文はないのですが、内在性のタンパクの場合は2xSDS buffer（加熱および還元剤については無記載）、FLAG-tagの場合は3xFLAGでeluteしたと記載してある論文はありました。IPでよけいなタンパクを除くと疎水性相互作用でヘテロオリゴマーになるリスクが下がる可能性があるのでしょうか？　この受容体はbeta-arrestin-2と結合してinternalizeされる事が報告されており、この結合が150kDaのバンドの原因ならば、IPしても駄目かもしれないですけど。 GPCRとかに関しては素人ですが、そういう生理的なinteractionというのは大抵は疎水性の強い膜貫通ドメインではなくて、ループなどの部分で起きるのではないでしょうか？ beta arrestinとSDSで壊れないようなヘテロダイマーを作っている、という心配はあまり必要ないような気もしますが。 それと、糖鎖修飾の専門家でもありませんが、膜貫通ドメインが本当に膜内にあるならば、そこにN-glycosylationの酵素がアクセス出来るとは直感的には思えないのですが… ちなみに、Research Gateでも同じようなQ&Aを見つけたので参考までに。 http://www.researchgate.net/post/Dimer_at_sds-page

(無題) 削除/引用 No.3544-20 - 2014/11/15 (土) 15:39:50 - おお ひとつきになったのは、SDSPAGEはごくまれにアミノ酸配列からの計算された分子量から大きく外れることがあるというなんですが、モノマーで修飾がなくても、計算上40kDaなのに80にでるようであれば、解決するのにかなり苦労するかもと、、、 大腸菌に作らせたりとかそう言う仕事はないでしょうかね。。。

(無題) 削除/引用 No.3544-19 - 2014/11/15 (土) 09:38:11 - CCR 糖鎖修飾について、詳しい方の御意見が伺えると助かります。とりあえずNetNGlycに入れてみると、この受容体の場合、ヒトでは細胞外領域に一カ所N-linked glycosylationのcandidateになるAsnがあるのですが、マウスでは保存されていません。ヒトでは他に２カ所、TMドメインにcandidateのAsnがあり、そのうちの一つはマウスでも保存されていますが、TMドメインの糖鎖修飾はあり得るのでしょうか？　O-glycosylationについては、N-termの細胞外領域とC-termの細胞内領域に、幾つかcandidateのSer/Thrがあるようです（NetOGlycに入れただけです）が、O-glycosylationを除去するには複数の酵素が必要みたいで、コスト的に手を出しづらいです。安価なキットでもあれば良いのですが。 一つ気になるのは、過去の論文のほとんどがIPで40kDaのモノマーを検出している事です。IP complexからeluteする際の方法を詳しく書いてある論文はないのですが、内在性のタンパクの場合は2xSDS buffer（加熱および還元剤については無記載）、FLAG-tagの場合は3xFLAGでeluteしたと記載してある論文はありました。IPでよけいなタンパクを除くと疎水性相互作用でヘテロオリゴマーになるリスクが下がる可能性があるのでしょうか？　この受容体はbeta-arrestin-2と結合してinternalizeされる事が報告されており、この結合が150kDaのバンドの原因ならば、IPしても駄目かもしれないですけど。 腫瘍組織の培養では、ストローマの細胞が一緒に入ってしまい、そこからリガンドが分泌される（培養上清中には複数のリガンドがかなりの量で検出されます）ので、刺激の遮断が困難です。本筋からは外れますが、逆にarrestinからアプローチするのも手かもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.3544-18 - 2014/11/15 (土) 01:19:12 - おお 疎水性の非常に高い蛋白で、非常ににた配列のヘテロだいまーをつくるタンパク質で、それぞれの分子量は約30kDaですが、どうしてもSDSPAGEで60kDaにくるタンパク質があります。ただしパーシャルに解離して30KDaにもダブレットが観察されます。最近では60kDaのバンドは蛋白の酸化のためにできたコバレントな結合ではないかともいわれていますが、尿素で60kDaのバンドは減る(完全ではなかったはず)ので、酸化による結合だけではないだろうとおもえます。 --- 糖鎖修飾はなんらかの形で否定しておかないとと思えますが、、、80kDaにくる報告がないのなら、それらの結果をもとにキャラクタライズした報告ができるように一セットのデーターをとっておくべきと思います。

(無題) 削除/引用 No.3544-17 - 2014/11/15 (土) 00:17:12 - CCR DTT 100mM添加サンプルをSDS-PAGEで流してウエスタンしてみましたが、 脾臓の80kDaバンドは全くそのまま、何の改善もありませんでした。 サンショウウオさん 再々ありがとうございます。DTTの結果もあわせ、おっしゃられるようにhydrophobic interactionがこの現象の主たる原因なのかなと、考えています。教えて頂いた掲示板の方と同じ事になってしまうような気もするのですが、 やるだけやらないと納得が行かないので、尿素は来週トライしてみたいと思います。幾つか、尿素がhydrophobic interactionを阻害する事を示す論文が出てますし、新規の試薬を購入する必要も無いので。結果がでたら報告させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.3544-16 - 2014/11/14 (金) 13:18:42 - サンショウウオ http://www.linkedin.com/groups/Membrane-protein-running-as-monomer-3740123.S.163439876 ここでも、ライセート調製条件とかを色々調整してやってもダメだった人がいます。プロトコルを描いている人や、ウェスタンブロットではなくSEC-MALSを提案している人も居ます。 　わたしは、基本的に受容体は疎水性相互作用で凝集した結果スメアがでたと考えています。 　比較的きれいなバンドが出ているなら、オリゴマーかなーと。 　受容体のシグナルが入りっぱなしの状態で、ライセートをボイルなしで調整したのならば、何らかのシグナル伝達に関わるタンパク質（βアレスチンとかGタンパク質とか）と受容体の複合体が150kDaとか80kDaで検出されたのではないかなと。その場合は、細胞に刺激が入らない状態を１２時間とか２０時間維持して（前培養して）シグナルを消失させた状態から、ライセートをボイル無しで作れば複合体は見れなくなるのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3544-15 - 2014/11/14 (金) 12:17:32 - おお >[Re:13] CCRさんは書きました : > おおさん > > すいません。もう一点お伺いさせて下さい。RIPA + 4x sample bufferで最終的なpHがどの辺りに来ているのかによっては、DTTよりTCEPの方が良いかもしれないと考えており、DTTで駄目だった場合の選択肢と考えています。自分のラボには無いので購入する必要があり、ちょっと業者のウェブ等を見てみましたが、Thermoのサイトで「尿素はシアン酸を形成してSH groupと反応するからTCEPを使う時の変性剤として勧めない」と記載がありました。サンプル処理でTCEPと尿素を併用する場合、加熱しなければ特にシアン酸は気にしなくてもいい気もするのですが、どうなんでしょうか？ TCEPは具体的に使用経験がないですから、、、まあDTTでも十分だとはおもいますけどね。TCEPで尿素が使いたいなら、さんぶるバッファーにTCEPをいれて、ゲルに尿素をいれるといいかとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3544-14 - 2014/11/14 (金) 12:13:29 - おお >[Re:12] CCRさんは書きました : > おおさん、独り言さん > > それで駄目なら、尿素を使おうと思うのですが、ウエスタン（というかPAGE）で尿素を使った経験がありません。一応ラボに尿素がある事は確認しましたが、飽和尿素というのは過剰量の尿素を水に入れて溶けた上清を使うという事でしょうか？　 そうです。要事調製しています。1.5mlえっペンを満たすぐらい尿素をいれて、水を入れて室温でローテーターでしばらくまわしてます。 濃度は温度によりますけど11Mぐらいにはなるとおもいます。サンプルには少なくとも4M、できれば6Mほどになるように入れたいのでその様にしています。きっちり濃度調整、計算してやったほうがすっきりするというならそうしてもかまいません。 尿素は蛋白に、熱などのたすけど悪さをするので、熱などで変性処理をしたい場合は、尿素なしでやり室温に戻ってから飽和尿素をどうりょうくわえてSDSPAGEにのせています。そうすると必要分しか処理しないので、尿素存在かで保存することもありませんから。 > > ゲルに入れる場合は、分離ゲルのみ尿素を入れるのでいいでしょうか？　間抜けな質問ですいません。一応サンプルとゲルの両方に尿素を入れようかと思っています。 濃縮ゲルはどちらでもいいでしょう。少なくとも濃縮ゲルで引っかかってないなら。

(無題) 削除/引用 No.3544-13 - 2014/11/14 (金) 09:27:25 - CCR おおさん すいません。もう一点お伺いさせて下さい。RIPA + 4x sample bufferで最終的なpHがどの辺りに来ているのかによっては、DTTよりTCEPの方が良いかもしれないと考えており、DTTで駄目だった場合の選択肢と考えています。自分のラボには無いので購入する必要があり、ちょっと業者のウェブ等を見てみましたが、Thermoのサイトで「尿素はシアン酸を形成してSH groupと反応するからTCEPを使う時の変性剤として勧めない」と記載がありました。サンプル処理でTCEPと尿素を併用する場合、加熱しなければ特にシアン酸は気にしなくてもいい気もするのですが、どうなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3544-12 - 2014/11/14 (金) 08:04:12 - CCR おおさん、独り言さん どうもありがとうございます。取りあえず手持ちのサンプルに100mM DTTを入れて、通常のSDS-PAGEで流してみます。 それで駄目なら、尿素を使おうと思うのですが、ウエスタン（というかPAGE）で尿素を使った経験がありません。一応ラボに尿素がある事は確認しましたが、飽和尿素というのは過剰量の尿素を水に入れて溶けた上清を使うという事でしょうか？　尿素の溶解度を調べてみると、20oCで水100gに尿素108gまで溶解できるようなので、最終的な体積にもよりますが、15Mくらいにはなるという事でしょうか？ ゲルに入れる場合は、分離ゲルのみ尿素を入れるのでいいでしょうか？　間抜けな質問ですいません。一応サンプルとゲルの両方に尿素を入れようかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3544-11 - 2014/11/14 (金) 05:28:31 - おお life technologies (in vitrogen)は還元剤抜きのサンプルバッファーをうっています。低温でSDSの沈殿をさけるためLDSをつかっているのと、還元剤の効果をたかめるためにpHがちがいますが、還元剤を入れるときの濃度が示されていますので、さんこうになるでしょう。 ttp://www.lifetechnologies.com/search/support/supportSearchAction.action?query=NP0008&supportSearchArea=Product+FAQs&initialSearch=true&refineSearch=true&mode=and&icid=pdp-faq-ar-NP0008 Can beta-mercaptoethanol (BME) be used rather than DTT as the reducing agent in the NuPAGE® LDS Sample Buffer? Either BME or DTT can be used in the NuPAGE® LDS Sample Buffer. Make sure that a fresh solution of BME is used. FINAL concentration: DTT 50-100 mM BME 2-5%

(無題) 削除/引用 No.3544-10 - 2014/11/14 (金) 03:00:52 - 独り言 MEがはいっているなら十分だと思うけど、どうしてもというのであれば、100mM DTTで切れないわけがない。

(無題) 削除/引用 No.3544-9 - 2014/11/14 (金) 02:19:07 - おお >DTTについては、やはり単独であるべきですか？　腫瘍サンプルに限りがあるので、bMEで処理した手元のサンプルにDTTを入れて試せたらと、ちょっと思ったのですが、邪道ですかね？ 個人的には大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3544-8 - 2014/11/14 (金) 02:10:20 - CCR yyyさん コメントありがとうございます。抗体に関しては、販売元のウェブを見ると、免染およびウエスタンで使えるとされており、ウエスタンで使用した論文もあるようです（残念ながら自分のラボからはフリーでこの論文を見れないので詳細は不明です）。ただ、Fab抗体なのでIPには使えません。こんな事になるならIPで使える抗体を買っておくべきでしたが、後の祭りです。 FACSについては、この抗体の他に、蛍光標識のモノクロで安いのがあったので、購入して試してみましたが、いずれも陰性でした。免染でみると、細胞膜上に存在するのはごく一部で、大部分が細胞内にあるようなので（この抗体が特異的である事が前提ではありますが）、FACSでの検出が困難なのではと考えています。この受容体のリガンドが腫瘍の微小環境で分泌されている事が分かったところからこの仕事が始まっており、この受容体はリガンドとの結合によりinternalizeされているかもしれません。 既報の論文でIPをかましている理由は、おそらく内在性タンパクの発現が低いためと考えています。サンショウウオさんに教えて頂いた掲示板をみても、GPCRは概して低発現とのコメントもあり、そうなのかなと。FACS用のモノクロでIPしてみようかとも考えたのですが、この抗体もIPで使える保証は 全くないので、ちょっと、という感じです。IP用の抗体（概して高価）を新たに買うのは最終手段と考えています（貧乏ラボなので）。 DTTについては、やはり単独であるべきですか？　腫瘍サンプルに限りがあるので、bMEで処理した手元のサンプルにDTTを入れて試せたらと、ちょっと思ったのですが、邪道ですかね？

(無題) 削除/引用 No.3544-7 - 2014/11/14 (金) 02:02:58 - おお 2-MEのかわりに DTT, TCEPなどをつかってみてください。どうじに reducing agentなしで比較してみてください。 ７回膜貫通型受容体はよくボイルによるアグリケーションがおこるようです。温度のほかに尿素によりアグリげーしょんをほどくというのも有効だと示された論文もみたことがあります。SAMPLE BUFFERてんか、処理ご後、等量のフレッシュな飽和尿素を等量加えるか、6Mほどの尿素を含んだゲルをつくるかするといいでしょう。 糖鎖修飾の可能性は考慮に入れてもいいかもしれません

(無題) 削除/引用 No.3544-6 - 2014/11/14 (金) 00:10:43 - yyy 使用してる抗体というのはWBで確かな実績があるものでしょうか？ IPをかましているというのは立体構造に依存してて変性後のWBでは検出効率が落ちるから、という可能性はないでしょうか？ まあ、FACSでネガティブだったということは発現してても低レベルな可能性もあるかも知れないので、そういう場合にも大量のlysateから濃縮する意味でもIPは有効なのかも知れませんが。 疎水性の強いタンパクは疎水性相互作用だけでダイマーを作る場合もあるので、その場合には還元剤は効かないと思いますが、ボイルしないという前提ならメルカプトエタノールよりもDTT単独の方が良いのではないでしょうか？

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