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qPCR不調の原因について トピック削除
No.3523-TOPIC - 2014/11/07 (金) 20:35:20 - KAPA
いつも参考にさせていただいております。
読みにくい点などございましたら申し訳ありません。

現在マウスES細胞から取得したcDNAを用いてqPCRを行い、mRNAの発現量を検討しております。
用いている試薬はKAPA SYBR FAST qPCRキットです。

ここ1ヶ月ほど以下の問題が発生しており困っております。

・検量線が上手く引けない
増殖曲線を見ますと、薄い希釈系の方が濃い希釈系よりも先に立ち上がってきてしまうことがままあります。

・ネガコンとして用いている水の立ちあがりが非常に速い

対策として
・プライマーの再希釈（100μM→10μM）2回
・水の作り直し 2回
・可能な限りラージスケールでの希釈（12μの水に対し4μのサンプルを加え希釈）
・希釈時数度ボルテックス
・グローブをはめて操作
・先輩と一緒に実験を行い操作の確認
・同じ機種（ABI 7500）だが別の機器を使用
・使用するキットの試薬およびチップの交換

等行いましたが改善しません。

Dissociation curveを見る限り、ピークは1つでプライマーダイマーの形成はありません。
（水はサンプルと同じ位置にピークが出てしまいますが…。）
増殖曲線の立ち上がりの位置も大方20前後で、サンプルが薄すぎるというわけでもなさそうです。
吸着も考えましたが、cDNA取得後すぐqPCRを行っても改善されません。

何か不足の点がありましたらご指摘願います。
どうぞ、よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3523-7 - 2014/11/21 (金) 23:45:01 - 悪地蔵
かなり鋭敏なマスターミックスですので、
・Primer
・MasterMix
・水
の全てについてコンタミを疑った方が良いと思います。

また、サンプル数が多いのであればフィルターチップの使用をお勧めします。

出入り業者さんに相談してサンプルをもらって試すのが良いかと思います。

自分も同様のトラブルに遭遇したことがありましたが、
Primerの原液にコンタミが判明するまで手間どりました。

(無題) 削除/引用
No.3523-6 - 2014/11/10 (月) 21:27:52 - KAPA
おお様

回答ありがとうございます。
はい、ピークの位置は一致しています。
また、泳動した際もバンドの位置に変化は見られませんでした。

以前4、5セットのプライマーを用いて解析した際にも水が高かったです。

明日解析する際はほかの方のお水をお借りして行ってみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.3523-5 - 2014/11/08 (土) 03:08:31 - おお
コンタミの可能性は高いですが、メルティングカーブは従来のものと一致してますか?

いろいろなプライまーセットで水を使ったときどうでしょうか?

補足 削除/引用
No.3523-4 - 2014/11/07 (金) 21:30:29 - KAPA
qPCR後サンプルを泳動したところ
水を入れたサンプルでバンドが確認されました。

ネガコンで増幅およびバンドが確認される理由にはどのようなものが
考えられるでしょうか。

過去の質問を見る限りコンタミかと思われますが、
試薬や水を交換しても治らないので、希釈前のプライマーを注文しなおしてみる必要がありますかね…。

(無題) 削除/引用
No.3523-3 - 2014/11/07 (金) 21:08:53 - KAPA
AP様

回答ありがとうございます。
なるほど、阻害性の物質ですか…。
逆転写後にRNase H処理はしておりませんので、RNAの混入が確かに考えられるかもしれません。

来週の月曜になってしまいますが、RNase H処理あり・なしのものを比較して
実験を行ってみようと思います。
ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.3523-2 - 2014/11/07 (金) 20:55:06 - AP
>増殖曲線を見ますと、薄い希釈系の方が濃い希釈系よりも先に立ち上がってきてしまうことがままあります。

逆転写反応産物に何かしら、阻害性の物質が含まれている可能性が示唆されます。
RNAの持ち込みかもしれません。逆転写後RNase H処理などされていますか。

qPCR不調の原因について 削除/引用
No.3523-1 - 2014/11/07 (金) 20:35:20 - KAPA
いつも参考にさせていただいております。
読みにくい点などございましたら申し訳ありません。

現在マウスES細胞から取得したcDNAを用いてqPCRを行い、mRNAの発現量を検討しております。
用いている試薬はKAPA SYBR FAST qPCRキットです。

ここ1ヶ月ほど以下の問題が発生しており困っております。

・検量線が上手く引けない
増殖曲線を見ますと、薄い希釈系の方が濃い希釈系よりも先に立ち上がってきてしまうことがままあります。

・ネガコンとして用いている水の立ちあがりが非常に速い

対策として
・プライマーの再希釈（100μM→10μM）2回
・水の作り直し 2回
・可能な限りラージスケールでの希釈（12μの水に対し4μのサンプルを加え希釈）
・希釈時数度ボルテックス
・グローブをはめて操作
・先輩と一緒に実験を行い操作の確認
・同じ機種（ABI 7500）だが別の機器を使用
・使用するキットの試薬およびチップの交換

等行いましたが改善しません。

Dissociation curveを見る限り、ピークは1つでプライマーダイマーの形成はありません。
（水はサンプルと同じ位置にピークが出てしまいますが…。）
増殖曲線の立ち上がりの位置も大方20前後で、サンプルが薄すぎるというわけでもなさそうです。
吸着も考えましたが、cDNA取得後すぐqPCRを行っても改善されません。

何か不足の点がありましたらご指摘願います。
どうぞ、よろしくお願いいたします。
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