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FACSでの細胞内染色＋2次抗体 トピック削除
No.3522-TOPIC - 2014/11/07 (金) 19:43:24 - KS+
大学院生です。長文すみません。
FACSにおける細胞内染色と2次抗体使用につきご相談させてください

現在マウスの組織において、
細胞内の分泌蛋白Ｘと表面マーカーＹを染色して
FACSでＸとＹの発現の分布を見たいと思っております。

Ｘに対する抗体はconjugateされている抗体がありません。
いくつかの検討により、うまくFACSでworkする抗体はanti-mouse抗X抗体（host rat）のみでした。2次抗体にPE Goat Anti-Rat Igを使用しています。
Ｙに対する抗体の選択肢は非常に少なく、現時点で売られている抗体は全て抗Y抗体（isotypeは Rat IgG2b)であり、Xのhostとかぶります。抗Ｙ-抗体APCを使用しています

本来はＸに対する1次抗体＋2次抗体で染色後、Ｙの染色をすべきところですが、
Ｘの染色は細胞内染色であるため、
表面マーカーＹの染色をしてから　Ｘの染色（1次抗体、2次抗体）をせざるをえない状況です。

固定、透過処理をしていても、やはりＸの2次抗体を入れた後にはＹの蛍光はほとんど消えてしまいます。（Ｘの染色をしていないsingle stainでは問題なく染まっています）

この抗体の組み合わせではもうＸとＹの染色を同時に行う手立てはないのでしょうか？
自分で抗体を作ったりconjugateするのが早いでしょうか？

何かいい方法があるという方、ご経験者の方いらっしゃったら教えてください
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3522-5 - 2014/11/19 (水) 07:56:13 - protein
固定、浸透処理をするとシグナルが消失するというのが奇妙に思います。
このような実験はIntracellular cytokine stainingの際によくやられており、
多くの場合PFAとサポニンベースの処理では、表面抗原由来のシグナルは影響を受けません。
シグナルが消えたと考えているのが、実は全体的にバックグラウンドが上がったために
差が見えなくなっているということはないでしょうか。
やはりこれといった良い案がありませんので、
コントロールをきっちり取ることと、conjugate抗体を作るということでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3522-4 - 2014/11/08 (土) 10:18:49 - おお
PLP固定
ttp://www.siyaku.com/uh/Shs.do?dspCode=W01W0129-6320

(無題) 削除/引用
No.3522-3 - 2014/11/08 (土) 10:11:14 - おお
>[Re:1] KS+さんは書きました :

> 本来はＸに対する1次抗体＋2次抗体で染色後、Ｙの染色をすべきところですが、
> Ｘの染色は細胞内染色であるため、
> 表面マーカーＹの染色をしてから　Ｘの染色（1次抗体、2次抗体）をせざるをえない状況です。

けっきょく固定して、透過処理を施すならどちらを先にしても状況は変わらないのではとおもいますが。

固定方法を少し工夫してみるとどうでしょう。膜蛋白とくに糖蛋白につよいPLP固定とかやってみてもいいかもしれません。

膜透過もdigitoninやtweenといったよりマイルドなデタージェントも使えるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.3522-2 - 2014/11/08 (土) 08:11:26 - SPC
抗Y-APCで細胞表面染色後、固定および透過処理をして、抗X一次抗体、二次抗体、という染色手順そのものには問題が無いように思うのですが。問題としては、細胞表面に既に結合している抗Y-APC抗体に、Xの二次抗体が結合してしまう事（Y陽性細胞がXの有無にかかわらずXの二次抗体で染まってしまう）ですが、これだけではYの蛍光が減弱する理由にはならないように思います。

Yを表面染色して固定および透過処理をしてから、X染色無し、一次抗体のみ、一次抗体と二次抗体、の３通り試して、二次抗体までやった場合だけYの蛍光が低下するのであれば、Xの二次抗体と抗Y抗体の間で何か起きているのかもしれませんね。ちなみに、Yの蛍光低下はPE陽性細胞だけで起きているのか、それともPE陰性細胞でも見られるのでしょうか？　

いずれにせよ、この二次抗体がXの一次抗体だけでなく抗Y抗体とも結合するのは問題なので、ラット以外の動物種からの抗X抗体を探すか、あるいは、今の抗X抗体をビオチン化して、二次抗体の代わりに蛍光標識ストレプトアビジンを使うか、対策を考えた方が良いように思います。

FACSでの細胞内染色＋2次抗体 削除/引用
No.3522-1 - 2014/11/07 (金) 19:43:24 - KS+
大学院生です。長文すみません。
FACSにおける細胞内染色と2次抗体使用につきご相談させてください

現在マウスの組織において、
細胞内の分泌蛋白Ｘと表面マーカーＹを染色して
FACSでＸとＹの発現の分布を見たいと思っております。

Ｘに対する抗体はconjugateされている抗体がありません。
いくつかの検討により、うまくFACSでworkする抗体はanti-mouse抗X抗体（host rat）のみでした。2次抗体にPE Goat Anti-Rat Igを使用しています。
Ｙに対する抗体の選択肢は非常に少なく、現時点で売られている抗体は全て抗Y抗体（isotypeは Rat IgG2b)であり、Xのhostとかぶります。抗Ｙ-抗体APCを使用しています

本来はＸに対する1次抗体＋2次抗体で染色後、Ｙの染色をすべきところですが、
Ｘの染色は細胞内染色であるため、
表面マーカーＹの染色をしてから　Ｘの染色（1次抗体、2次抗体）をせざるをえない状況です。

固定、透過処理をしていても、やはりＸの2次抗体を入れた後にはＹの蛍光はほとんど消えてしまいます。（Ｘの染色をしていないsingle stainでは問題なく染まっています）

この抗体の組み合わせではもうＸとＹの染色を同時に行う手立てはないのでしょうか？
自分で抗体を作ったりconjugateするのが早いでしょうか？

何かいい方法があるという方、ご経験者の方いらっしゃったら教えてください
よろしくお願いいたします。
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