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(無題) 削除/引用 No.3520-11 - 2014/11/08 (土) 17:58:21 - hana 回答ありがとうございます。 サンプルがそろっているのでしたら、そういう発現ということなのでしょうか。 ポスドクの方の方が遅いのでしたら、単純に、あなたの方がサンプルの持ち込みが多いとか。 チップを深く入れすぎていると、チップの周りについてくるサンプルも多くなるわけで。 まあGAPではみられないとのことなので、そんな簡単なことでもないかとは思いますが。 ただ、PCRをかける際にネガコンを一緒にかけないというのはそれ以前のはなしで。 RTネガなりPCRネガなりがないものはありえないのですが…。 今は練習のつもりでやっておられるのかもしれませんが、ポスドクの方にお願いをして、せめてPCRネガだけでも一緒にかけていただくようにしてください。 mixを作る際に少し多めに混ぜていますよね？ その残りとかでいいので、1枠ネガを作ることをお勧めします。 それで、ネガで立ち上がりがなければ、少なくともダイマーではないとはっきりするので、他の原因を考えるきっかけにはなりますよね。

おお先生 削除/引用 No.3520-10 - 2014/11/08 (土) 08:04:55 - みこまち 泳動も提案してみましたが未だに許可が出ず、私の手技を見直すように言われております。 ご提案、ありがとうございます。

hana先生 削除/引用 No.3520-9 - 2014/11/08 (土) 08:03:05 - みこまち サンプルはtripleでかけています。 triple以上ではかけたことがありません。 ウェル間ではバラツキほとんどありません。 私だけのデータだとバラつきはないのですが、ポスドクの人と私のデータが合わなくて困っています。 Ct値はあるmRNAに対しては私は27くらいの時ポスドクの人は30くらいです。 私が23でポスドクの人が29というmRNAもあります。 ダイマーかと思って教授にも言ってみましたが、「なんでそう思うのかわからない」と言われて終わってしまいました。。 貴重なアドバイスありがとうございます。

seven先生 削除/引用 No.3520-8 - 2014/11/08 (土) 07:54:18 - みこまち お返事が遅れて失礼しました。 なるほど手技の差があるのかを先生が仰るような方法で試してみるのもいいですね。かなり真似をしてポスドクの人と同じやり方をしているつもりなのですが差が出てしまうので一回やってみようかと思います。 発現量が少ないとちょっとの差が結果に大きく反映させてしまうのですね。 「混ぜ方が悪いからだ」と教授には言われているのでかなり頑張って混ぜているのですが完全にポスドクの人とは同じデータが出ずにおります。 プライマーセットのチェックなどはおそらく行っていないと思います。 私は下っ端なので実験に関することに意見できる立場ではないのですが、本当はやってみたいです。 �刧僂T法で解析していますが、私の知る限りそのプライマーで増幅効率の確認もしていないと思いますし。。。 ネガコンをリアルタイムPCRにかけることも提案はしていますが、許可が出ずしていません。。 私は分子生物学素人なので、自分の手技だけを疑ってましたが他にも原因がありそうですね。 「キミの何かが悪いんだから何が悪いか考えなさい」と言われて凹んでいましたが先生のお話しうかがって少し元気が出ました。 詳しい説明ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3520-6 - 2014/11/08 (土) 00:15:05 - おお プライマーダイマーやノンスペかもしれないとわたしもおもうのです。。。PCR productsを直接電気えいどうしてみるのもてです。

(無題) 削除/引用 No.3520-5 - 2014/11/07 (金) 19:54:00 - hana Ct値が小さいというのはどのあたりなのでしょうか？ 立ち上がりがあまりにも遅い場合は経験上ダイマーかな…と思ってしまいますが。 あと、サンプルをtripli以上でかけて、きちんとそろって上がっていますか？

(無題) 削除/引用 No.3520-4 - 2014/11/07 (金) 18:17:18 - seven 追加でもう一つ 融解曲線の違いはプライマーダイマーかもしれないので、テンプレートを入れないネガティブコントロールで融解曲線とCt（理想的なプライマーなら蛍光はネガコンではは立ち上がってきませんが）を確認してみてください。

(無題) 削除/引用 No.3520-3 - 2014/11/07 (金) 18:05:57 - seven 低発現量のものではピペッティングやチップやチューブへの吸着などの少しの差が大きく結果に影響してきます。 手技の差によるものなら例えばPCRプレートやチューブへのロードまでのステップはポスドクの人にやってもらってロードだけあなたとポスドクの人でやってみて差があるようならロードのステップに問題があり、差がないようならロード以前のステップに問題があるということです 手技に致命的ミスがないにも関わらず、差が出るような場合はそもそもそのプライマーセットは低い発現量を定量するには良くない場合もあります。 希釈系列を作ってターゲットの発現量がCtと濃度（希釈率）が直線的な相関をしているレンジ内に入ってることを確かめたほうがよいです。 絶対定量ではもちろんですがデルタCtの場合もデフォルトでは増幅効率を2としている場合が多いので1度は確認しておかないと正しい定量ができません。 低吸着のチップやチューブを使うだけでも低発現領域での直線性が改善されることがあるのでinputのcDNAの量を増やすことが出来ない場合は試してみても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3520-2 - 2014/11/07 (金) 17:34:50 - みこまち すみません 「発現量の少ないプライマーを使った時に」ではなく 「発現量の少ないmRNAのプライマーを使った時に」です。 脱字失礼しました。

融解曲線とCt値の個人差 削除/引用 No.3520-1 - 2014/11/07 (金) 17:25:16 - みこまち いつも勉強させて頂いております。 リアルタイムPCRについて教えてください。 今はポスドクの方のお手伝いをさせて頂いているのですが、私とポスドクの方とで結果が異なり悩んでおります。 ラボではsybr greenを使っています。 私とポスドクの方とで融解曲線がの形が異なり、Ct値も3くらい変わってしまいます。 私の方が融解曲線がブロードになり、Ct値も小さく出てしまいます。 この現象はGAPDHなどでは起こらず、発現量が低いプライマーを使った時に起こります。 サンプルは氷上に置き、プレートへの分注も氷上、プライマーはforward, reverseを先に混ぜてからマスターミックスに加えるなどポスドクの方の手技を真似ても結果が異なります。 この問題が解決しないとリアルタイムPCR禁止なので焦っております。 何か原因や改善点がありましたらなんでもいいのでコメント頂けると幸いです。 よろしくお願いします。

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