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(無題) 削除/引用 No.3520-34 - 2014/12/03 (水) 22:29:38 - 横槍ですが >いえ、ポスドクの方はリバースピペッティングではなく普通のピペッティングです。 >だからチップ内に徐々に溶液が残ってしまう感じです。 これは致命的です。雑魚毒なりなんなりアダ名をつけてあげましょう でも一方で >ポスドクさんの再現性については、測定のPCデータのラベリングはテンプレートを流用していて面倒だから変えてないだけで、他のものを測ってる実験だった〜とかいうオチもあり得ますよ。 は充分有り得ると思います（てきとーそうな人だからこそ高確率で） 泣き寝入りし、わだかまりと悪い伝統を残すぐらいなら「データを覗いてこうでした」とハッキリ言う方がいいのでは？と思います 貴方の勘違いがどこかにあるかも知れないし、教授が自分の勘違いに気付く機会かもしれない。ポスドクの人にとっても、この国の厳しい研究費予算にとっても、大事なことかもしれない。疑問は言ってみればとりあえず何か分かるでしょう その結果、何か不都合なことが起こるようであれば別の研究室に移ればいいだけです（移動先は見積もっといた方がいいです）。最悪、研究だけが人生でもないです 正直、このスレッドを見て自分の居た研究室にかなり似ていると思いました みこまちさん、黙ったまま逃げるのはそのポスドクの人と何も変わらないのではないでしょうか？黙ったまま居続けるつもりならなお悪いです 私事ですが、研究室配属当時、論文投稿されていた先輩の実験の誤りを指摘してしまったせいか、私は2年間リアルタイムPCR禁止措置で、ろくに結果も出せずサンプルもいつも誰かに捨てられてました。が、現在研究者になれています ついでに、教授に目をかけられていた同室者のデータ改竄も提出して去りました（実験スタートに当たる発現量データが嘘なので3年間の実験費用・時間が水の泡という面白い状態です） 現在思うのはもっと早くハッキリと疑問は口にし、もっと早く誘ってくれていた教授の部屋に移るべきだったということです 研究室・研究所の中身は千差万別で、良いところは凄くいいです。大事な若い時間を一番悪いところで「こんなもんか」と過ごすことのないように願います

(無題) 削除/引用 No.3520-33 - 2014/11/21 (金) 23:47:07 - 悪地蔵 cDNA中にgenomeDNAが混入しているのが原因で 類似のトラブルを経験したことがあります。 どこかでお役に立つかもしれないと思い書きました。

(無題) 削除/引用 No.3520-32 - 2014/11/12 (水) 17:02:44 - 後ろ向き 融解曲線の形状が違うだけでTmはそんなに違いませんか？ プライマー対を取り違えてたり、ラベルを間違えたりということはありますので。。 あと、発現量が低いサンプルで多く出てるってことは鋳型のコンタミが考えられますよね。まーネガコンないからわかんないけど・・ 量が少ないと、融解曲線が同じようにはとれないこともあるし。（もちろん定量性にも問題あり） ポスドクさんの再現性については、測定のPCデータのラベリングはテンプレートを流用していて面倒だから変えてないだけで、他のものを測ってる実験だった〜とかいうオチもあり得ますよ。 まあ、、ネガコンがあって泳動して、そもそも生データをわだかまりなく突き合わせられればいいんで、書いててトホホとも思いますが、、 ラボによっていろいろ歴史もありますしね〜 「正しい結果だと自分が確信を得るには、どういう実験が必要か」だけに専心するしかない、、かな？

ありがとうございました 削除/引用 No.3520-31 - 2014/11/12 (水) 16:48:37 - みこまち 皆様 たくさんのコメントありがとうございました。 いい歳して久々に悔しくて泣きました。 でも先生方のコメントを読み、今出来ることをちゃんとやろうと前向きになれました。 今回の件でリアルタイムPCRのこと、ピペット操作のことなどとても勉強になりました。 今後は今回得た知識や手技を活かして実験出来るように頑張ります。 メンタルなアフターケアまでして下さって本当にありがとうございました。 うっかりコメントを消してしまい、再投稿したのでコメントの順番が変わってしまい、失礼致しました。

seven先生、おお先生 削除/引用 No.3520-30 - 2014/11/12 (水) 16:39:34 - みこまち 連名でお返事を書く失礼をお許しください。 解決はしていないのですが、私が実験から外れることで解決（？）することになりました。。 色々コメントして頂いのに申し訳ありません。 実はルール違反だと思うのですが、リアルタイムPCRにつながっているPC（PCRを操作したりデータを保存するPC)のポスドクの方のデータを見てしまいました。 (ポスドクの方からは全然情報開示がないので、失礼は承知で見ました） 私が聞いていたCt値は１回実験のもので別の日のCt値を見ると私とほぼ同じになっていました。 どうやら日によってCt値が違っていたようです。 値にして２の違いが出ていました。 でも勝手に見てしまったので教授には私が聞いていた値と違うし、(ポスドクの方が）別の日に測定したものは私の値にむしろ近いということは言えず。。 やんわりと「ポスドクの方のデータの再現性も一度見てください」とお願いしましたが「彼のことは信用している」と言われ却下でした。。 で、「君は定量にむいてない」と言われて残念ながらリアルタイムPCRからは撤退です。。今後は何をするのかまだ決まっていません。 皆さんにたくさんのご助言を頂いたのに活かすことが出来ずに申し訳ありません。 解決ではないのですが解決（？）してしまったので締め切らせていただきます。 先生方、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3520-29 - 2014/11/12 (水) 16:36:39 - hana うわぁ、それはなんというか…。 正直なところ、上の人の方が手技的なことも含め難ありというのはままあることですが。 『ばらつきの小ささは教授にも認められています』とこのことですから、 とりあえず、言われた仕事をこつこつしていれば、また頼まれることもあるかもしれませんし。 ポスドクの方だって、なにがしか思うことはあったのでしょう。 でないと、データ開示がないとうのが…。 今回は落とし所がここだったんだなと思うしか。 ともあれ、おつかれさまでした。

R先生 削除/引用 No.3520-28 - 2014/11/12 (水) 16:36:38 - みこまち いえ、ポスドクの方はリバースピペッティングではなく普通のピペッティングです。 だからチップ内に徐々に溶液が残ってしまう感じです。 ラボの方針というより個人個人の決め事のようです。 コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3520-27 - 2014/11/12 (水) 16:28:25 - おお いちど生データーの取り扱いで全体で話し合いをする方向に(これとは無関係ということで、本当は意図的なんですが)持っていけるといいかもですね。そのポスドク以外で比較的教授と話ができる人に相談するなら。

(無題) 削除/引用 No.3520-26 - 2014/11/12 (水) 16:20:57 - おお まあそのポスドクのことはほっといて、後で困るだろうから。割り当てられた他のことをきっちりこなせればそのうち信用はでてくるでしょうし、自分の研究で必要になればqPCRも自然とやる機会はまたでてくるでしょうし、こんなばかばかしいことでつまづいていても仕方がないのでqPCRの手技は修得して次のことにチャレンジするとでもおもえばいいかと。 ポスドクのほうはmeetingでデーターを発表するときにそのうちぼろが出てくるかもしれませんので、別に攻撃しているようでないようにとれる賢いやり方で鋭く質問をするといいかもしれません。 あとあのピペットの使い方をかいたやつをプリントしてそのポスドクの目がつく所にわざとそのページを開けて置いておけば(落としておくとかでもいいかも)読んで自分の間違えに気がつくかもしれません。

これは．．． 削除/引用 No.3520-25 - 2014/11/12 (水) 16:14:33 - 無 ペーパーとして表に出てくるかどうかはともかく、正しくなさげなデータが正しいものとして残っていくことになるので、これを解決とするのはあまりにも．．． ポスドクさんの手技が改善されないだけに留まらず、様々な方向に様々なレベルで悪影響が及ぶものと思いますので、ある程度の発言力があり信頼できる近くの方に相談した方が良いと思います。 そういう人がいないのでこちらでトピをたてられたんでしょうけど．．．

(無題) 削除/引用 No.3520-22 - 2014/11/12 (水) 15:05:29 - seven 一応解決したみたいで良かったです。 とはいえ、ピペッティングの手技の差（多く見積もっても20%ぐらい）でCtが3ほど（原理的には8倍）も違うというのは正しいレンジでの定量ができていないっぽいですね。

(無題) 削除/引用 No.3520-21 - 2014/11/12 (水) 13:15:39 - おお >[Re:20] Rさんは書きました : > >私はチップの中身を全部押し出す派、ポスドクの方は押し出さない派でした。 > > ポスドクの方は常にリバースピペッティング？ > 2段階目まで押して吸引 → 1段階目までしか吐出しない あ、これ気になりますね。もしかしたらポスドクの方の方が正しくない使いかたしているかも。。。 ピペットのマニュアルを一度よんでみるといいでしょう。 http://www.technosaurus.co.jp/pdf/manual/PF_201001.pdf page 6-7 正確にピペッティングできているか、またはピペットがおかしくなってないかは、水をピペッティングして重さをはかればわかります。微量の場合はピペッティングをくりかえして、10回分の量とか、30回分の量とか、天秤ではかれるレンジにあわせるといいです。 あとぶれ方がちょっと大きすぎるとは思いますが、それぞれスタンダードをとることで、結果が一致しているかをみてみるというのがやれることかなっと。

(無題) 削除/引用 No.3520-20 - 2014/11/12 (水) 10:14:23 - R >私はチップの中身を全部押し出す派、ポスドクの方は押し出さない派でした。 ポスドクの方は常にリバースピペッティング？ 2段階目まで押して吸引 → 1段階目までしか吐出しない real-time PCRの調製でリバースピペッティング必要ないとは思いますけど、 ラボの方針なら仕方ないですね。

さく先生 削除/引用 No.3520-19 - 2014/11/11 (火) 23:12:18 - みこまち ご回答ありがとうございます。 ピペットマンの補正は全くされていないようです。 ピペットマンに限らず、メンテナンスが行き届いてないラボなので… 参ったものです。 お忙しいところご教授ありがとうございました。

GT先生 削除/引用 No.3520-18 - 2014/11/11 (火) 23:09:03 - みこまち ご回答ありがとうございます。 今日のダメ出し会で私のピペット操作は悪くないことがわかり、安心しました。 でも私はあくまでポスドクの方のお手伝いなので手技を完全模倣することになりました。 完全模倣するのは慣れるまで少し時間がかかりそうですが、立場上やらなくてはならないので早く慣れようと奮闘中です。 お忙しいところありがとうございました。

AC先生 削除/引用 No.3520-17 - 2014/11/11 (火) 23:03:24 - みこまち ご回答ありがとうございます。 ばらつきの小ささは教授にも認められています。 なので何で結果がポスドクの方と合わないのかと不思議がられています。 今日のダメ出し会でポスドクの方のやり方を完全模倣するということになり、それで個人差が埋まるのか試しています。 明日、結果が出るので緊張しています。 ご教授ありがとうございます。

hana先生 削除/引用 No.3520-15 - 2014/11/11 (火) 22:53:22 - みこまち ご回答ありがとうございます。 お礼が遅れて失礼致しました。 今日、ポスドクと教授を含めてダメ出し会が開かれまして… どうやらピペットマンの使い方が問題なのかも知れません。 私はチップの中身を全部押し出す派、ポスドクの方は押し出さない派でした。 教授からポスドクの方に手技を全て合わせるように指示されたので今日はポスドクの方のやり方(ピペット操作まで)を完全模倣してリアルタイムPCRをかけました。 明日、結果が出るので緊張しています。 色々アドバイスありがとうございます。 私がもう少し信用されて自主的に実験出来るようになったらhana先生から教えて頂いたことやってみます。 ご指導ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3520-14 - 2014/11/10 (月) 09:14:32 - さく ピペットそのものは、そのポスドクの方と同じものを使用しているのでしょうか。 リアルタイムPCRは反応液量が少ないので、ピペット精度が悪かったりするとずれる可能性があります。10uLピペットなんかはなかなか自分で確認するのも難しいのですが…。メーカーメンテに出せると良いのですけれど。

(無題) 削除/引用 No.3520-13 - 2014/11/09 (日) 09:46:14 - GT ポスドクでもリアルタイムPCRを原理を知らなかったり、 プライマー設計を間違っているような輩もいるので、 自分が間違っていると決めつけず、徹底的に原因を追究することが ラボのためにもなる、と思って頑張って下さい。 その際、ポスドクさんに原因があったとしても それを強調しないようにすると、ラボの雰囲気も悪くならず 教授、ポスドクさんともに仲良くやっていけるのではないでしょうか。 頑張ってください。

Re: 削除/引用 No.3520-12 - 2014/11/09 (日) 08:19:57 - AC >泳動も提案してみましたが未だに許可が出ず、 ひどい話ですね。流してバンドで確認すればダイマーかどうか一発でしょうに。ネガコンも置けないとはあまり理想的なラボ環境ではないようですが、こればっかりは仕方ないですね。 Ct値に関しては、ポスドクの方が遅い傾向なんですね。てっきり逆かと。発現量も30前後なら、発現が弱すぎることによるブレというのはなさそうです。Triplicatesであまりぶれないとのこと、あなたの手技の問題ではなさそうです。 実は、ポスドクさんの方が下手というオチですかね。ポスドクさんと同時に、同じプレートに載せるように、それぞれTriplicateでやってみて、ばらつきを比較してみたらいかがでしょう。当然、Ct値が小さくてバラツキの少ない方のデータを信じたくなります。

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