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(無題) 削除/引用 No.3514-8 - 2014/11/12 (水) 00:47:30 - ゲノム初心者 APさん、hanaさん、ありがとうございました。 お二人の言われるとおり、パラフィン切片の腫瘍細胞(+いくらかの正常組織も混じっていると思います)から抽出したDNAですから、野生型とLOHが混ざっていても不思議ではないですよね。複数のプライマーで複数回試してそれぞれ同じ結果ですから、これでボスに相談してみます。

(無題) 削除/引用 No.3514-7 - 2014/11/11 (火) 10:11:28 - hana QIAGENのカラムをお使いなのでしたら、そちらで十分なのですが。 私はQIAGENのBufferが余るので、エコノスピンを使っているので。 APさんがおっしゃるように、腫瘍部分全てがmutationを起こすわけではないので、 結果がばらつくことは私も経験があります。 サンプルからの抽出の仕方によっても変わってくるんじゃないかと。 あと、プライマーのかかりやすさとか。 そこら辺の考察は、むしろ所属されているラボの先生とご相談されるべきなのでは…

(無題) 削除/引用 No.3514-6 - 2014/11/10 (月) 20:49:48 - AP 腫瘍だとヘテロジナスな細胞集団かもしれなくて、全くの野生型やLOHが混じっているとか

(無題) 削除/引用 No.3514-5 - 2014/11/10 (月) 18:49:22 - ゲノム初心者 hanaさん、具体的なカラムを紹介頂きありがとうございました。 私はいつも濃縮や精製を行う時には、キアゲンのキットに付属のカラムを代用しておりました。早速次回試してみたいと思います。 お世話になりついでで申し訳ないのですが、結果についても相談してもよろしいでしょうか？ パラフィン切片(今回は髄膜腫の組織でした)から抽出したDNAを用いたシークエンスの結果が、使用したプライマーによって結果が異なった場合、どのように考察するのがよいでしょうか？ 例えば、プライマー1で行ったらミスセンス変化+/-(F鎖R鎖ともに、2度施行)、プライマー2で行ったらミスセンス変化+/+(F鎖R鎖ともに、2度施行)、再度サンプルDNAを希釈せずにプライマー1を使ったらミスセンス変化-/-(F鎖R鎖ともに)だった場合で、コンタミの可能性はきわめて低いと仮定します。プライマー設計には、一応PubmedのSNPデータベースに報告されている部位は避けています。 私見では、このサンプルの正解は+/-で、抽出したDNAが切れていたりでサンプルの質が悪く、PCRが片方だけから多くかかったり、もう一方のアレルだけから増幅が多かったり、上手くいけば(プライマーがいい場所だった)両方のアレルが読める時があるのかなと考えたのですが、どうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3514-4 - 2014/11/08 (土) 18:20:08 - hana 単純にどこの製品がいいともいえないかとは思いますが。 スメアになるのでしたら、サンプルをもっと希釈してみると案外きれいにかかったりもしますし。 お使いになられているKitは脱パラが不要のもののようですが、それでも、出来る限りパラフィンを除いてから抽出作業をされるとDNAの質は上がるかと。 あと、抽出後のサンプルを一度カラムに通すだけでもかわりますよ。 https://www.bio-bik.co.jp/p-TubeSpin.html

(無題) 削除/引用 No.3514-3 - 2014/11/08 (土) 02:51:21 - ゲノム初心者 hanaさん、ありがとうございます。 私がパラフィン組織用に使っている抽出キットは、TaKaRa DEXPATです。 抽出はプロトコルどおりに行って、PCRで上手く増幅できない時はエタノール沈殿までは試します。 しかしながら、製品に書いてある400bpはおろか、時に200bpすら増幅できないことも多々あります。もちろんサンプルの保存状態などの品質に大きく依存することは理解していますが、濃縮してみても、ほとんどの場合結果は変わりません。 やはりQIAGENの方がよさそうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3514-2 - 2014/11/06 (木) 20:08:21 - hana 現在ご使用になられているKitはどのようなものでしょうか？ 私はKitならQIAGENのものばかり使っていますが、 FFPEならProKで溶かすだけでKitは基本使用していませんが。

抽出後のゲノムDNAの精製について 削除/引用 No.3514-1 - 2014/11/06 (木) 00:58:57 - ゲノム初心者 いつもこの掲示板にはとても助けられております。ありがとうございます。 私は、ヒトの血液や組織から抽出したゲノムDNAを使って、ダイレクトシークエンスを行っています。ですが時々、抽出したサンプルの吸光度の260/230値が低かったり、電気泳動でひどいスメアが出て、その後のPCRやシークエンスがうまくいかないことがあります。抽出キットはいろいろなものを使用していますが、特にパラフィン切片から抽出したものの純度が低くて困っています。 どなたか、抽出後のゲノムDNAを再度精製するのによいキットをご存じないでしょうか？ もしくは、ダイレクトシークエンスのためにパラフィン切片からDNAを抽出するのに優れたキットを教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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