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(無題) 削除/引用 No.3503-16 - 2014/11/14 (金) 08:12:05 - nc ありがとうございます。 on iceで５分おきのボルテックスでよいのですね。 この方法を試してみます。

(無題) 削除/引用 No.3503-15 - 2014/11/14 (金) 07:52:37 - ウエスタンですが 細胞をPBSでWash後、ハイポバッファーを加えピペッティング。アイスに入れてインキュベート15分、その間ボルテックスを5分おきにかけました。遠心を800rcf、4度で5分程度行い、大まかに核と細胞質を分けました。この時点で細胞質分画はちょっとにごった感じです。（核分画は特に心配せず、1度洗って細胞溶解液で溶かしました。）その細胞質のほうを使っている遠心機の最大スピードで回しました。今ノートを見たら2時間回していました・・・4度で16krcfくらいです。でもクリアな上澄みができたと記憶しています。お役に立てれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3503-14 - 2014/11/14 (金) 05:29:25 - nc detergentなしhypotonicバッファーに細胞を懸濁してから遠心までの 操作を伺ってもいいでしょうか？ on ice にしばらく置くだけ？　 それともグラスホモジナイザー等でホモジナイズでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3503-13 - 2014/11/14 (金) 01:24:20 - ウエスタンですが 最近私も核-細胞質分画しました。hypotonicバッファーでdetergentなしでロースピンで核と細胞質を大まかに分け、細胞質分画をさらに高スピンでクリアなスーパーネイタントを細胞質分画としました。（このときのペレットは捨てる。）チュブリンとヒストンでウエスタンをしたのですが、高遠心前の細胞質分画ではまだ少しうっすらとヒストンのバンドがでたのですが、遠心あとのクリアなものにはほぼ出ていませんでした。参考までに。

(無題) 削除/引用 No.3503-12 - 2014/11/13 (木) 13:43:56 - おお ttp://www.sciencemag.org/content/315/5808/97.figures-only ちょっと今読めませんが、この辺りから方法を引っ張ってくることはできますか?

(無題) 削除/引用 No.3503-11 - 2014/11/13 (木) 11:55:22 - nc 紹介いただいた以下の方法を試してみました。 ttp://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/nuclear-extraction-method-.html また、他にもNP-40を0.1%加える方法、さらにdetergentは使わずに hypotonic bufferに細胞を懸濁後、douce homogenizerでホモジナイズする方法、 などを試してみました。 いずれも細胞膜破壊後1000g, 10min, 4Cで遠心し細胞質と核を分けました。 核はさらに３回洗浄しました。 が、試したいずれの方法でもはじめの質問に書いたのと同様に、 細胞質画分にかなりの程度で核内由来の物(U6 RNA)がコンタミしてしまっています。一方核画分には細胞質由来のもののコンタミは見られませんでした。 核由来のコンタミの無い、きれいな細胞質画分を得られるよい方法、おすすめの プロトコルがあったらどなたか教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3503-10 - 2014/11/04 (火) 06:01:44 - おお >[Re:9] ncさんは書きました : > 遠心速度が速すぎると（前回は16000g, 15分間遠心）それが核膜を > 破壊して内容物が細胞質フラクションへ混入してしまう原因になるでしょうか？ 1000g 10 min で十分です。とくにdetergentがfreeなどの条件ではそのgではミトコンドリアやエンドソームなどの膜フラクションがまじるとおもいます。 まあ弱い遠心でもミトコンドリアは核周辺に局在するので、くっついているものはコンタミしますけど。ミトコンドリアのコンタミは実験によっては無視しているものがおおいです。

(無題) 削除/引用 No.3503-9 - 2014/11/04 (火) 05:01:02 - nc みなさま、 たくさんのアドバイスをいただき、ありがとうございます。 NP-40の濃度を0.1%に下げてみようかと思います。 また並行してdetergentは使わずHypotonic bufferも試してみようかと思います。 細胞膜破壊後、核をペレット化する時の遠心速度については何か助言は あるでしょうか？ 遠心速度が速すぎると（前回は16000g, 15分間遠心）それが核膜を 破壊して内容物が細胞質フラクションへ混入してしまう原因になるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3503-8 - 2014/11/04 (火) 01:47:42 - ぶんぶん まずはウエスタンで分画できているかどうかを確認してみるのはどうでしょうか？うちはNP-40ではなくトリトンを使いますが、0.5%で問題なく分画できていますよ。

(無題) 削除/引用 No.3503-7 - 2014/11/02 (日) 09:44:08 - おお detergentを多く使うプロとコールでは、核周辺のミトコンドリアなどをなるべく除去する配慮が入ったものがあるとおもいます。この場合、核膜も除去してしまうわけですが、低イオン強度ではカクマトリクスがintactなので、核の構造は保たれているというのが、そのプロとコールでの判断基準です。ただ流出しているものは当然あるとおもってもいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3503-6 - 2014/11/02 (日) 08:03:59 - mon digitoninを利用するprotocolもあります。細胞膜は溶かし核膜には作用しにくいdetergentです。 以下はRNA抽出用のprotocolではありませんが、参考になるでしょう。 http://www.nature.com/protocolexchange/protocols/1994 核膜には作用しにくいとは言っても、何回も使えば核膜もダメージを受けますから、最初の溶解時に使用し洗浄時には使わない方が良いです。使っても1回かな。 また、トリプシン処理は必要ですか？293細胞なら冷PBS（+EDTA)だけでも剥がれますよ。 私はいろいろシグナルが細胞内に入るのを避けるため、洗浄後dishに冷溶解液を添加しラバーポリスマンで回収する方法を多用します。溶液が多めになるのが難点ですが。

(無題) 削除/引用 No.3503-5 - 2014/11/02 (日) 02:16:31 - おお hypotonicでは核はこわれません。核膜孔があって小分子が自由にではいりできますから。

(無題) 削除/引用 No.3503-4 - 2014/11/02 (日) 02:13:58 - おお あ、ちょっと濃度見てませんでした。。。頭にあるプロとコールをかくのは面倒だからぐぐったのですが、、、 NP-40は入れないプロとコールもあります。入れるプロトコルで見たことあるのは0.1%ぐらいです。高ければ細胞膜を確実に壊すことができるけど、核膜へのダメージとかかくないのものの溶出の危険が増します。この辺は目的次第かといってもいいかもしれません。 ようは細胞がこわせる最小限の濃度が決めれればベストです。これは使っている細胞や、可能な細胞けんだく液の濃度にもよります。 NP-40をつかわず、ニードルにシリンジで通すか、スケールがそこそこおおきいならPotter-Elvehjem PTFE pestle and glass homogenizerでマイルドな細胞破砕にするといいです。

(無題) 削除/引用 No.3503-3 - 2014/11/02 (日) 01:55:47 - nc おおさん アドバイスありがとうございます。 教えていただいたプロトコル、細胞をHypotonic Buffer(20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2)に懸濁して氷上15分おき、そこへファイナル0.5%となるようNP-40を加え10秒ボルテックスの後に3000 rpmで10分遠心とのことです。 0.5% NP-40というのは私が用いた条件と同じですし、さらにこのプロトコルではHypotonic Bufferを用いているので、私が用いたプロトコルよりさらに核膜が壊れてしまいやすいのではないかとちょっと心配なのですが、どうでしょうか？ （というか、このプロトコルでうまくいくなら、なぜ私が用いた方法ではうまくいかなかったのだろうかと思案しています。） 遠心の速度の違いは核膜の壊れやすさに影響を及ぼすでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3503-2 - 2014/11/02 (日) 01:30:27 - おお その塩濃度とデタージェント濃度では、核内のものはかなり溶出していると思います。 ttp://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/nuclear-extraction-method-.html こちらのしたのほうにある protocol の1-8までの手順でやればどうでしょうか。 8のあとNP-40はいらないからHypotonic Buffer Solution で核のフラクションを洗えばいいかと思います。

細胞分画(核-細胞質)について 削除/引用 No.3503-1 - 2014/11/01 (土) 23:08:57 - nc ヒト培養細胞(HEK293)を核と細胞質画分に分けるべく次のように実験を行いましたが、うまくいきませんでした。 1. HEK293細胞をトリプシン処理, 1xPBSに懸濁し1000gで遠心を2回繰り返す。 2. 懸濁液A(50mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM KCl, 5mM MgCl2, 0.5% NP-40, 1 mM DTTの溶液)に懸濁しP1000チップで10回ほどやさしくパイペッティングし、氷上に　１０分。 3. 4℃で16000g, 15分間遠心。 4. 上清を細胞質画分として回収。沈殿は懸濁液Aにやさしく懸濁して3の条件で再度遠心、これをもう一度繰り返す。沈殿を核画分として回収。 その後各画分からTrizol溶液を使用してRNAを精製し、ノーザン解析にてRNAを検出。 すると細胞質画分に核内容物であるU6 RNAが大量に(核画分に見られるのよりも たくさん)検出されてしまいました。つまり細胞質画分に核内容物がかなりの濃度で混入しているようです。 この細胞質画分のプロトコルのどこかに問題、改善点があるでしょうか？ 4のステップで核沈殿を懸濁液Aに再懸濁しようとしたところ、沈殿が白く大きなベトベトした塊のようになっていて、まともに懸濁できませんでした。 3での遠心の速度が速すぎて核膜が壊れているという可能性があるでしょうか？ その場合遠心速度は1000gくらいにするべきでしょうか？ もしくは0.5% NP-40というのは濃度が高すぎで、0.1%程度に下げるべきでしょうか？ とても困っています。何でもよいのでアドバイスをいただけると助かります。 よろしくお願いします。

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