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(無題) 削除/引用 No.3497-9 - 2014/10/31 (金) 10:06:22 - GT 皆様 コメントありがとうございます。 確かに40サイクルでやっと、というのが気になったので シークエンスしてみました。配列は間違いなかったので発現はやはりあるのかと思います。 また、他の組織でというコメントもありましたが、先行研究では 他の組織でほとんど発現してなかったのと、自分でやっても （マウスですが）確かに今回標的の組織でしか発現が見られないのでかなり厳しそうです。 ＞ちょっとこれ難しいでぇ、やってみぃとかいって同僚にプライまーセットをわたしてみる これができると最高ですね。このアイデアはなかったです！ 経費が掛かることを考えて自分で取り出そうと思いましたが、 皆さんの意見にもあるように購入するということも視野に入れて 探してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3497-8 - 2014/10/31 (金) 08:55:55 - Harmonia > ref sequenceなどからしらべて購入可能か確認する。 とおおさんが書かれているとおり、誰かが配列情報を公開したから、それをもと にPCRの設計ができたのですよね？ NCBI のref sequence (NM_xxxxxxxx) には、 ・cDNAクローンの全長配列 ・cDNAクローン達の断片配列の合体 が混じっているので、註釈を読み解く必要は有りますが、ref sequenceの 元になった配列が何かは、記述があるはずなので、情報を綱渡りしていけ ば、元のクローンの名前に行きつくことができる場合が多いです。 例えばいまNANOGをおもいついたのでNM_024865.3をみると、 PRIMARY REFSEQ_SPAN PRIMARY_IDENTIFIER PRIMARY_SPAN COMP 1-248 DC425336.1 2-249 249-1293 AK290896.1 215-1259 1294-2076 AC006517.46 69693-70475 c 2077-2103 AI656990.1 1-27 c で CDS 220..1137 なので、5'側欠けますがAK290896.1の元クローンを入手できればよい。 AK290896.1の塩基配列の少し上の注釈を見ると、 /clone="NCRRP1000153" と書かれているので、NCRRP1000153を買えばいい。 Google検索すると、「NBRC / ヒトcDNAクローンの分譲 - 製品評価技術基盤機構」 っていうのがありますね。 ちなみに、NM_024865.3の3' UTRは、cDNAじゃなく、ゲノム配列AC006517.46 からの類推だと思われます。

(無題) 削除/引用 No.3497-7 - 2014/10/31 (金) 04:43:54 - 独り言 最近使ってないから、最新の情報はわからないが、トータルcDNAからのPCRならKOD FX neoが好きだった。他の校正機能が高いだけの酵素とは違い、増幅効率が良くて、校正機能が高いpolでは増えない場合でもKOD FX neoを使ってクローニングバンバンできた。校正機能もちゃんとあるので、変異が入った事もほとんどなかった。Accuprimeは使った事ないので、わからん。

(無題) 削除/引用 No.3497-6 - 2014/10/31 (金) 03:50:43 - おお そうですねぇ。わたしも40cycleでうっすら出てきても特異的なバンドかじしんがないですねぇ。そういうざいりょうからRTPCRをするのは勇気あるなぁとおもうわけで、、、

(無題) 削除/引用 No.3497-5 - 2014/10/31 (金) 00:06:55 - cDNA 40サイクルでやっと見えるバンドって、本当に目的遺伝子かどうか疑わしいよな、といつも思っています。特に200bpなんてサイズが小さい場合は。私がGTさんだったら、まずそのうっすら見えるバンドを切り出して、シークエンスにかけて間違いないかどうかを調べます。 間違いないことが確認できたら、monさん、おおさんのアイデア以外で、 1) Flag配列＋制限酵素の配列がPCRがかからない理由と疑っているのであれば、まずはリバースプライマーはそういう配列が追加されていないものを使ってEasy-A酵素を使ってPCRしてTAクローニングする。このPCR産物+TA vectorから切り出すなり、PCR産物+TA vectorを鋳型にしてFlag配列＋制限酵素の配列のリバースプライマーを使ってPCRするなりしてタグ付きvectorを作る。 2) ヒトのRNAサンプルからcDNAを作る際に、Oligo dT primerの代わりに目的遺伝子配列specificなprimerを使う。私はこれでPCRがうまくかかるようになった経験があります。

(無題) 削除/引用 No.3497-3 - 2014/10/30 (木) 21:27:40 - おお 発現が高い細胞や組織を探す。 ref sequenceなどからしらべて購入可能か確認する。 だれかクローニングしてベクターにはいったconstructを作ってないかpublicationをさがす(あればそこからもらう). Nested PCRをかける (ttp://dspace.jorum.ac.uk/xmlui/bitstream/handle/10949/12070/page44.htm) genomeの構成をみてみる。 しこたまtotal RNA を精製してそこからさらにpolyA RNAを精製する(polyAがついているなら)。 二等分、三等分などして全体がカバーできるpartial fragmentをとりあえず得る。 全長合成を依頼する。 どっか業者に相談してクローニングを依頼できないか聞く。 ちょっとこれ難しいでぇ、やってみぃとかいって同僚にプライまーセットをわたしてみる。 あきらめる。

(無題) 削除/引用 No.3497-2 - 2014/10/30 (木) 21:09:21 - mon (1)Mg濃度を増やす（1.5x,2x)。GC-richな配列なら5%DMSOや0.5~1M betainを加える。AccuprimeがTaqベースなら酵素を変える。 (2)完全マッチする（余分な配列のない）30bpほどのprimerで2-step PCRを行う。 (3)伸長時間が10分の2-step PCRを行う。 (4)200bp~500bpほどの断片を増やし（末端は別のPCR産物と20~30bpほどオーバーラップするように設計）、PCR産物同士を末端のprimerでPCRを行い連結する。 (5)完全合成する。cDNAを購入する。

40サイクル以上でバンドがやっと見える遺伝子のクローン 削除/引用 No.3497-1 - 2014/10/30 (木) 20:01:52 - GT いつも勉強させていただいております。 ヒトのRNAサンプルからcDNAをPCRクローンして Expression vectorに入れて細胞で発現させようと実験をしているのですが、 PCRがうまくいかないので質問させていただきました。 まずcDNAをPCRプロダクトが200bpsになるプライマーでPCRをやりました。 すると40サイクル回すと薄くバンドが出てきました。 発現量はだいぶ低いですが、発現があることが分かったので、 全長用のプライマー（Reverse側にはFlagを追加できる設計）で PCRを40サイクルしたのですが、PCRプロダクトを得ることができませんでした。 Flag配列＋制限酵素の配列がある分、プライマーが長くなっているのが 原因かとも思っていますが、これまで40〜50bpsのプライマーでも うまくいっていたので今回困っています。 など私ならこうする、というコメントをいただけると幸いです。 標的cDNAは1000bps、PCRの酵素はAccuprimeを使っています。 よろしくお願いいたします。

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