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(無題) 削除/引用 No.3495-8 - 2014/10/31 (金) 10:42:52 - 774R >ligaseもない状況下でセルフラーゲーションってなにが起きているんだろう？ ligationしないでもコロニーが出た場合、それは切れ残りのベクターが混在してたってことだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3495-7 - 2014/10/31 (金) 10:39:07 - おお >[Re:5] TOPOさんは書きました : > おお様 コメントいただき感謝しております。 > > >Tとか出っ張っててself がおきにくくなっているのに取れたというならちょっとなんか変なことが起こってるような気がしてちょっと気持ち悪い。 > > 私もそのような感覚を持っています。既に切断されているのにligaseもない状況下でセルフラーゲーションってなにが起きているんだろう？あり得ないことなのでは？と感じています。電気泳動では確認できないほど小さなDNA断片が入ってしまっている可能性の方が大きいでしょうか？ 現実そういう、どういうわけかEcoRV(でしたっけ)が生きた状態で平滑でライげーしょんが起こったと思われるクローンは取れることはとれます。 でもなんだか気持ち悪いでしょっていうだけのことです。もちろんなんかはさまったものもとれるでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.3495-6 - 2014/10/31 (金) 10:27:46 - 774R >TOPO TAクローニングでセルフライゲーションというのは実際起こりえるんでしょうか？ 100%の割合でベクター末端にTが付加されてるとは思えませんし、経年変化により何らかのヌクレアーゼの影響でTが除去されて平滑末端になってしまう可能性もありますし、セルフライゲーションの可能性は十分にあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3495-5 - 2014/10/31 (金) 09:52:45 - TOPO おお様 コメントいただき感謝しております。 >Tとか出っ張っててself がおきにくくなっているのに取れたというならちょっとなんか変なことが起こってるような気がしてちょっと気持ち悪い。 私もそのような感覚を持っています。既に切断されているのにligaseもない状況下でセルフラーゲーションってなにが起きているんだろう？あり得ないことなのでは？と感じています。電気泳動では確認できないほど小さなDNA断片が入ってしまっている可能性の方が大きいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3495-4 - 2014/10/31 (金) 09:50:23 - TOPO 774Rさん コメントいただきありがとうございます。 はい、ライゲーション時にはその点を気を付けます。 あるいはligation後にEvoRVで切断してセルフライゲーションしたものを切った後、transformationも考えています。 根幹のところの疑問ですが、TOPO TAクローニングでセルフライゲーションというのは実際起こりえるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3495-3 - 2014/10/30 (木) 13:05:50 - おお >[Re:1] TOPOさんは書きました : > このキットでは青白セレクションも出来ないようですし、経年によってセルフライゲーションしてしまう割合が増えているとしたら（あり得ますか？）、TAクローニングで目的のものを拾うのは大変そうだなという印象です。ただ、コマーシャルなpcDNA3.1 V5-Hisは持っていないので、TAクローニングで「失敗（？）した」セルフライゲーションのものを使ってもいいのかなと考えました。 > > どうなんでしょうか？ いいよ。 ただそのベクターがself ligation の時に変なことがおきてないということがかくじつなら。Tとか出っ張っててself がおきにくくなっているのに取れたというならちょっとなんか変なことが起こってるような気がしてちょっと気持ち悪い。 もしほかのものを入れたベクターがあればそこからインサートを切り出して、(必要であれば)ベクターを平滑末端にして、入れてもいいんじゃない。

(無題) 削除/引用 No.3495-2 - 2014/10/30 (木) 12:17:43 - 774R TAがうまくいかない理由はいろんな可能性があると思うので割愛しますが、EcoRVを利用して挿入する事自体は問題ないです。ただし、以下の点に注意が必要です。 ・ベクターが再びセルフライゲーションしないように、脱リン酸化する必要があります。 ・一方、インサートであるPCR産物はリン酸が付いてないので、プライマーの段階でリン酸化するかPCR産物をリン酸化する必要があります。

TAクローニングのセルフライゲーションベクターについて 削除/引用 No.3495-1 - 2014/10/30 (木) 11:14:46 - TOPO TOPO TAクローニングが上手く行きません。インサートは4 kbで、TOPO TAクローニングのpcDNA3.1 V5-Hisを用いています。5年以上も前のものです。 TAクローニングは何度もしていましたが、今回だけ上手く行っていません。 そこで、3'末端にAを付けないPfuで目的遺伝子をPCRした後、セルフラーゲーションしていた（つまり目的遺伝子が入ってくれなかった）pcDNA3.1 V5-HisをEcoRVで処理してblunt-endでligationも可能（フレーム読み枠が合うことは確認しました。）かなと思っていますが、こういうことってやってもいいのでしょうか？ このキットでは青白セレクションも出来ないようですし、経年によってセルフライゲーションしてしまう割合が増えているとしたら（あり得ますか？）、TAクローニングで目的のものを拾うのは大変そうだなという印象です。ただ、コマーシャルなpcDNA3.1 V5-Hisは持っていないので、TAクローニングで「失敗（？）した」セルフライゲーションのものを使ってもいいのかなと考えました。 どうなんでしょうか？

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