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(無題) 削除/引用 No.3494-13 - 2014/11/03 (月) 21:43:00 - f みなさん、貴重なご意見ありがとうございました。 大変勉強になりました。 とりあえず、やってみます（笑

(無題) 削除/引用 No.3494-12 - 2014/10/31 (金) 23:35:52 - おお >[Re:11] クロリンさんは書きました : > バッファーで細胞を溶かす前に、0.5〜1.0％パラホルムアリデヒドで細胞固定（タンパク複合体の固定）する方法も見たことがあります。一般的な方法かどうかはわかりませんが、どなたかご経験ありますか？ やったことあります。ホルムアルデヒドでクロスリンクができるので、ほかのクロスリンカーをかうよりは、すぐに実験に取りかかれるのでまずはそれでやってみたりしてます。 ホルムアルデヒドのかわりにグルタルアルデヒドを使うこともあるようです。グルタルアルデヒドはbaxのおりゴマー検出とかでも使われていたとおもいます。ホルムアルデヒドはChipあっせいでポピュラーな方法になりましたが、ChipではDNAとタンパクの複合体のクロスリンクをねらってますね。 ちなみに濃度はホルムアルデヒドで細胞をを処理したとき0.1-0.5%で条件をふりました。0.1でも十分見れました。

PHA固定 削除/引用 No.3494-11 - 2014/10/31 (金) 15:54:06 - クロリン バッファーで細胞を溶かす前に、0.5〜1.0％パラホルムアリデヒドで細胞固定（タンパク複合体の固定）する方法も見たことがあります。一般的な方法かどうかはわかりませんが、どなたかご経験ありますか？

(無題) 削除/引用 No.3494-10 - 2014/10/31 (金) 10:53:11 - おお >[Re:9] fさんは書きました : > > fractionationは検討したいです。アドバイスありがとうございます。 > 調べを始めたところなんですが、膜、細胞質、核、の３つにわける方法ってありますか？ > よくやられるのが、核をとるプロとコールでhypotonicなバッファーで細胞をはれつさせておいて、1000gかそれ以下の遠心で核をおとします。pelletになった核は2、3回同じバッファーであらえば、核たんぱくが主にえられます。 上澄みは超遠心で100000gで10-30minまたは高速遠心機で30000gで30min以上とかで膜を回収すれば細胞質とぶんりできます。遠心はマイクロチューブ用の遠心で1時間ぐらいでもそこに膜フラクションを回収できることはできます。 膜タンパク質を回収する別の方法としてはtriton-x114で膜を可溶化して、30度ぐらいか、もうちょっと高い温度にするとtriton x114は曇ってきて水から分離しますので、分離したものをなるべくその温度で遠心して回収すれば、疎水性のつよい膜タンパク質はtriton x114に巻き込まれてpelletにきます。ただし膜表面にあるタンパク質は回収できないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3494-9 - 2014/10/31 (金) 07:47:11 - f > おおさん 豊富なご経験に基づくアドバイスありがとうございました。 RIPAでもよいのですね。SDSが結構入っていると思うので（0.1%ですかね？）、 これはちょっときついだろう、と思っていたのですが。普段、ライセートを作るときは RIPAでやってるので、まずはこれでやってみようかと思いました。上手くいくかは わかりませんが...。 fractionationは検討したいです。アドバイスありがとうございます。 調べを始めたところなんですが、膜、細胞質、核、の３つにわける方法ってありますか？ > monさん おっしゃるように、取りたいタンパクの性質によっては2価陽イオンが必要なものもたくさんあるでしょうから、盲目的にEDTAを入れるというのも考えものですね。アドバイスありがとうございます。 デタージェントの選別がいつも悩むところです。悩む理由は、デタージェントの性質はいろいろ知られていますが、どこまで実験的に整合性が合ってるのか、と思ってしまうからです...。みんな、たまたま上手くいったものを使ってるだけなんでは、、、と。 抗原ー抗体反応だけは維持して、その他のタンパク間結合はdisruptする、っていうデタージェントとか使用経験ありますか？あ、から始まるデタージェントだったと記憶してるのですが、なかなかみつかってこない...。 磁気ビーズは昔少しだけ使ったことがあって、確かにノンスペが少ないな、と思っていました。 たまたまかな、と思っていたのですが、こちらも検討したいと思います。でも、もうセファロースビーズ発注しちゃいましたが...。

(無題) 削除/引用 No.3494-8 - 2014/10/30 (木) 21:39:51 - おお あれ、おれもまちがえてるじゃん。 Y2Hやそれの応用でほかの生物種をつかったもの(大腸菌とか)なども結合を示す実験としてありかと思いますが。この場合は直接結合してないと難しいですね。 直接結合しているなら、リコンビナントを作って両者が結合するか調べてみるとか、片方をリコンビナントで細胞からのlysatesとまぜpull downとか(この場合は直接でなくてもいいですけど)いうのもありですね。 細胞のlysateもtotalでなくって、細胞質で結合しているなら細胞質だけをとるとか、膜や膜表面にあるなら膜フラクションをとるとか、フラクショネーションしてみるとやりやすくなる可能性はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3494-7 - 2014/10/30 (木) 17:14:58 - mon Nananさん、 正解です。ありがとうございます。 おおさん、 どうしようもないときに、DSPによるクロスリンクも使います。 これでダメなら抗体(epitope)が悪いか、結合していない、と判断して、次に進みます。

(無題) 削除/引用 No.3494-6 - 2014/10/30 (木) 16:09:35 - Nanan >[Re:5] おおさんは書きました : > >じゃなくってCHASPとみた。 > > CAPSじゃなくってCHASPとみた。 でもなくて、CHAPSとみた。

(無題) 削除/引用 No.3494-5 - 2014/10/30 (木) 13:15:55 - おお >じゃなくってCHASPとみた。 CAPSじゃなくってCHASPとみた。

(無題) 削除/引用 No.3494-4 - 2014/10/30 (木) 13:13:50 - おお じゃなくってCHASPとみた。 もし結合がみられないなら、デタージェント抜きでやるのもてかも。ノンスペで結合が見られないならデタージェントの組み合わせで一番ノンスペが少ないといわれる RIPAとか一番厳しい条件でまずやってみるのも手かもしれません。 理屈上やれる手数はいろいろあるのでうまくいかなければ切りがない可能性もありますので、Plan Bもあった方がいいのではないかと。クロスリンクとかはやってみることがあります。

(無題) 削除/引用 No.3494-3 - 2014/10/30 (木) 12:37:00 - mon 私の実験ではMg、Ca、Znあたりが必要なものがあるので、EDTAは入れないでProtease Inhibitor Mixを入れることが多いです。さらにMg 1mM、Ca 0.01-0.1mM、Zn 0.01mM（のどれか）を補ったりすることもあります。 界面活性剤はNP40よりTritonX-100を汎用しています。CAPS、Octylglucosideあたりが2nd choiceです。 Glycerolは、非特異的吸着を減少させる効果(水素結合を切るから？）があると言われていますが、経験的に効果的だったことがほとんどないです。粘性が出るので、デブリが沈みにくくなる効果があるかも。 アガロースビーズより（親水性表面を有する）磁気ビーズの方が非特異的吸着が少ないですね。

(無題) 削除/引用 No.3494-2 - 2014/10/30 (木) 09:41:29 - おお どの様にうまくいかないかにもよります。ノンスペがでるなら、厳しい条件にしていくでしょうけど、塩濃度あげるか、detergentをあげるか、変えるか2種類以上のdetergentのコンビネーションなどの選択しもありますけど、detergentとあなたのみたいIP complexとの相性もありますから、単に強いdetergentを選べばいいというものでもありません。

IPのBuffer 削除/引用 No.3494-1 - 2014/10/30 (木) 09:18:16 - f みなさん、Immunoprecipitationをされるときのバッファーの選択ってどのポイントを注意されてますか？ はじめてやるIPで選択するバッファーって、ご自身のスタンダードがあるのか、文献を参考にしてそれに合わせるのか、どうされてるかなと思いまして。 私は、文献等はまず当たりますが、だいたい 50 mM Tris/HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1-0.5% NP-40, 10% glycerol （グリセロールは入れないこともあります。グリセロールある、なし、で何が変わるのか、 よくわからないんですが、実は...。ライセートが調製しやすいという実感はあるのですが。コンプレックスをとってきたいときにはよいのかな） を基本にcell lysateとbinding reactionをして、washは炎濃度とNP-40濃度を適宜上げて 調節してまずはやってみます。 IPは今まであんまり上手くいかないことも多いので、バッファー選別の考え方がそもそもよくないのかな、と思いまして質問させてもらいました。ご意見いただけると幸甚です。 ちなみに、今回の目的は、ウェスタンブロッティングでトリプレットのバンドがみえた抗体でそれらのバンドの配列決定をしたいのと、その結果次第では、後々、コンプレックス精製してmasspec解析、です。

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