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(無題) 削除/引用 No.3485-6 - 2014/10/27 (月) 22:58:42 - おお もしかしたら変異ではなくって、スプライシングのパターンが変化したのでは?あるいはNMD活性が違うことによりクリぷティックなスプライシングプロダクトが増えたとか。 スプライシングのパターンの変化はそのエクソンの前後のエクソン近傍の変異でも起こるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3485-5 - 2014/10/27 (月) 19:27:13 - ~ トラブルが起きている場合は、まずは現状の確認をしましょう。 ゲノムDNA、mRNAと各プライマーの位置を図式化し、 シークエンシングにより確認ができている配列と、 未確認の配列を色分けしてみてはいかがでしょうか。 それを見れば、どの部分に問題がないと判断できるのかが分かります。 ゲノミックPCRのプライマーがアニールする部分に"も"変異が入り 増幅しないようになっていると仮定すれば、結果に矛盾はないと思います。 それを否定できる、手持ちの細胞で変異型のアリルのゲノムDNA配列を確認した等の情報は書かれていませんね。 また、片方の配列のみが得られたというのはどのような意味で、 その結果はどの位固いのでしょうか？ 真っ先に疑うべき部分だと思いますが、既成事実のように書かれていますね。

(無題) 削除/引用 No.3485-4 - 2014/10/27 (月) 19:18:01 - 774R >（プライマーはイントロンにあります） 変異型はイントロンの配列も異なっており、プライマーが働かない可能性は？ エキソン中の配列のプライマーでゲノムを増幅するべきかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3485-3 - 2014/10/27 (月) 19:08:24 - へんい ご返答を頂きましてありがとうございます。 変異の説明をしておくべきでした。 変異は点変異ではなく、欠損なのです。 インフレームで数塩基が欠損し、アミノ酸が数個〜10数個欠損します。 従いまして、PCRのエラーでは無いと考えています。

(無題) 削除/引用 No.3485-2 - 2014/10/27 (月) 18:54:09 - R 逆に、RTかPCRでエラーが入った可能性の方が高いようにも思います。 RT-PCR用の酵素の中には、 増幅効率優先で校正活性の低い酵素が使われているケースは ままあると思います。

RT-PCRとゲノムPCRの結果が異なる 削除/引用 No.3485-1 - 2014/10/27 (月) 17:48:51 - へんい 腫瘍の変異をPCRとシーケンシングでチェックしています。 RT-PCRでは変異型のシーケンスだけが得られました。 RT-PCRでの増幅サイズは200bpです。 しかし、ゲノムDNAからは野生型のシーケンスだけが得られました。 ゲノムPCRでは、1個のエクソンをブリッジするようにプライマーを設計して、 目的のエクソンが含まれるように設計してあります（プライマーはイントロンにあります）。 野生型のアリルが発現していないのはメチル化で説明できると思いますが、 ゲノムPCRで変異型が増幅できなかった理由が分かりません。 変異型は何らかの原因で、ゲノムをテンプレートとした時に増幅できないのだろうと考えます。 もしご存知のかたがおられましたら、ご教授頂けますようお願い致します。

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