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(無題) 削除/引用 No.3484-11 - 2014/10/29 (水) 13:53:44 - え >[Re:8] ~さんは書きました : > 急冷法は、確率的にそれでも当たりが取れるから行われているのだと思います。 > 取れればいいということなら、混ぜただけでも取れたとしたらそれでもいいよ、ということですかね。 そうではなくて、原理をちゃんと考えて、効率のよい方法をとるべきではないですか？

(無題) 削除/引用 No.3484-10 - 2014/10/28 (火) 00:42:40 - おお ゆっくり冷やす方がより安定な構造を得やすいのでよくやられます。 急に冷やしても、直後ではあニールしてないものが多いでしょうけど、やはりDNAどうしの会合はできます。ただし、ミスアニーリングなども多くなると思います。そう言うものが邪魔をしないなら急冷でもいいかもしれません。 ゆっくり冷やす代わりに、アニーリング温度より少し低めでしばらくincubationするのもありかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3484-9 - 2014/10/27 (月) 17:46:34 - mbb 便乗で質問させてください。 以前CKOさんと同様のアイデアでアニーリングを 試みたのですが、うまくいきませんでした。 95℃からゆっくり一晩かけてアニールしたのですが 電気泳動で確認したらスメアな状態になっていまし た。１本鎖のDNAを同じ条件で加熱・放冷したもの は1バンドでした。DNAはおよそ70merでした。 予算も無いのでスメアな状態のDNAを酵素処理して プラスミドに入れたところ、2コロニーだけ目的 配列の挿入されたプラスミドを持つ大腸菌を得る ことができました。 何回アニーリングしてもスメアなバンドしかえら れなかったのですが、何が原因か理解できずに いました。今はこの仕事とは別のことをしている のですが、この実験のことがずっと気になってい ます。 合成DNAをアニーリングする際、こういうことは よく起こるのでしょうか？ あるいはこのような失敗をするような原因として どのようなことがあり得るでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3484-8 - 2014/10/27 (月) 16:43:54 - ~ 急冷法は、確率的にそれでも当たりが取れるから行われているのだと思います。 キャピラリーPCRのアニーリング時間は短ければ1~数秒ですので、 on iceで冷える間のごく短時間でもある程度の量のアニーリングは起きるのでしょう。 アニーリングの際のオリゴDNAは過剰量ですし、 セルフライゲーションがほとんど起きない条件でサブクローニングすれば、 当たりは得られるのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3484-7 - 2014/10/27 (月) 15:45:01 - え 急冷は初耳です。 むしろ分子内や分子間の水素結合すらできないのでは？ 水素結合も可逆的なので、ゆっくり温度を下げると、ついたり離れたりを繰り返して、より安定な結合（分子間の二本鎖）ができやすいという原理だと思っていたのですが。 ちなみに、Sigmaのプロトコールです。 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/custom-dna/learning-center/annealing-oligos.html

(無題) 削除/引用 No.3484-6 - 2014/10/27 (月) 15:20:51 - 774R >ゆっくり温度を下げると分子内で水素結合を形成して構造を組み易いと考えられるので、沸騰するぐらいの高温にチューブを入れたあとに氷上に プライマーのアニールは分子間の水素結合をさせるのが目的ですから、急冷では分子間の水素結合を形成する時間が短くなりアニールの効率が悪くなると考えられます。 もちろん40bpにも及ぶ相補鎖を持つオリゴ同士の分子間の水素結合のほうが、分子内で起こるミスマッチを含む水素結合よりも優先的に起こることが前提にあります。

急冷 削除/引用 No.3484-5 - 2014/10/27 (月) 15:06:16 - ふみ ゆっくり温度を下げると分子内で水素結合を形成して構造を組み易いと考えられるので、沸騰するぐらいの高温にチューブを入れたあとに氷上に移して、冷えてから塩を入れるようにしていました。 Tmが80度とのことなので今回は氷冷する必要はないでしょうけれど。

(無題) 削除/引用 No.3484-4 - 2014/10/27 (月) 14:35:12 - ~ 制限酵素用バッファーMがアニーリング用バッファーとほぼ同じ組成です。 制限酵素用バッファーはかなり余るため、手抜きしたいときはこれでやっていました。

(無題) 削除/引用 No.3484-3 - 2014/10/27 (月) 08:33:04 - CKO なるほど、確かにTmは80を越えていました。 以下の書き込みを見つけました。 (10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). The presence of some salt is necessary for the oligos to hybridize. NaClを加えるとは全く知りませんでした。 大変貴重なご指摘いただき誠にありがとうございます。 では、TEにNaClを加え、それでブロックヒーターで95℃まで加熱して、3min後に電源を切って自然冷却を行うことにします。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3484-2 - 2014/10/27 (月) 08:18:14 - 774R 40merもあったらアニーリング温度は60℃なんてものじゃないだろうから、60℃で3分間は意味がないように思います。 よくやるのは、100ccくらいのビーカーでレンジでお湯を沸騰させた後、そこにチューブを入れて、ゆっくり冷まして行く方法。冷めながらどこかでアニールするという寸法です。ゆっくり冷ますのは、プライマー同士が正確にアニール出来るからです。ブロックヒーターで加熱して、電源を切って自然冷却でも構いません。 バッファーはTENというNaCl入りのTEを使います。 アニールは数十μM程度でやると思いますが、ライゲーションするときは物凄いモル数になるので、1000倍とか1万倍くらい希釈してベクターに加える感じです。

プライマー同士をアニールさせる条件 削除/引用 No.3484-1 - 2014/10/27 (月) 07:45:50 - CKO いくつか関連のトピックが過去にありましたが、それらでは解決できなかったので質問をさせてください。 約40ヌクレオチドほどのプライマーペア（お互いが相補的です）をアニールさせ、その後制限酵素処理したベクターにライゲーションしたいのですが、この際のプライマーのアニール（ハイブリダイズ？）の条件はどうすべきでしょうか？ 私が想像するに、まず各プライマーを等量まぜ、分子内アニーリングを除くため95℃, 3 minほど処理した後、60℃前後で3 minくらい処理したものを直接用いれば大丈夫でしょうか？これらをサーマルサイクラーを用いて行って行こうと思っています。初めてですので、もし間違ったことをしていましたらご指摘お願いできませんでしょうか。よろしくお願い致します。

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