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(無題) 削除/引用 No.3482-3 - 2014/10/27 (月) 13:21:13 - ~ >約２倍にG418を増やして後者の方法でダブル導入株を取っている方がいました。 遺伝子増幅のために薬剤濃度を増やしたことがありますが、 別の遺伝子を導入するというのはやったことがありません。 後者の方法で2個目の遺伝子が導入された細胞を得るためには、前提条件として ・G418濃度が２倍では細胞が死ぬことが確認されている ・遺伝子増幅により既に入っている薬剤耐性遺伝子が増える頻度よりも、 　新しく入れた遺伝子が組み込まれる頻度の方が十分に高い あたりを満たす必要があるでしょう。 >早くて確実に目的の細胞が取れる 速さについては、今の手持ちの材料で目的の細胞が取れるのであれば、後者の方が早いでしょう。 ただ、予備検討で2倍の濃度で死ぬのかを調べるのであれば、薬剤を替えた方が早いでしょう。 確実さについては、後者で元々の細胞が２倍のG418に耐えられていた場合は、２個目の遺伝子が入る頻度はとても低くなるでしょう。 また、後者できちんと２倍の薬剤耐性の表現型でセレクションできたとしても、１個目の遺伝子増幅によるもので２個目の遺伝子が入っていない場合もあるため、確実さは前者よりも劣るでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3482-2 - 2014/10/25 (土) 11:19:59 - おお まあとれれば早いかもしれませんが、確実な方法とまではいえません。あまりそう言うのは見たことがありませんし。

２つのプラスミドの安定発現細胞株樹立法 削除/引用 No.3482-1 - 2014/10/25 (土) 08:44:35 - TaK 今G418（500 ug/ml）入り培地で飼っている細胞株に、もう一つ遺伝子を導入したいです。 そのプラスミドもG418で選択するものです。 この場合、他の薬剤抵抗性遺伝子のプラスミドバックボーンにinsertを乗せ替えるか、 より高濃度のG418でdouble stable transfectantを取る方法があるかと思います。 前のlabでは、約２倍にG418を増やして後者の方法でダブル導入株を取っている方がいました。 細胞にもよるとは思いますが、早くて確実に目的の細胞が取れるとしたらやはり前者なのでしょうか？ ご経験ありましたら、どうかご教示ください。よろしくお願いします。

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