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wet transferとsemi dry transferの違いについて教えてください トピック削除
No.3481-TOPIC - 2014/10/25 (土) 08:33:40 - 転写
140 kDaのタンパク質をwestern blottingで検出するためにPDVF膜へ転写したいです。
S社のgoatポリクロを購入して検出を試みていますが、バンドが何もでません。
この抗体の使用実績はありません。

ただし、S社のこの抗体（ロットも同じ）のページを見るとmouse brain extractでシングルバンド、しかもかなり強いシグナルが認められています。

S社に問い合わせをして、一つを除く他全ての条件を同じにしてもだめでした。
唯一違うのが、transferの仕方です。

S社からは4˚C, オーバーナイトのtransferと回答いただきましたが、私の環境にwet transferの環境がないため、semi dry式で1時間半transferしてみました。

この転写方法で、GAPDH (約40kDa) や130 kDaのタンパク質は検出できています。
やはり抗体が悪いんでしょうか。S社の抗体はみなさんご存知のように外れが多い印象です。（もちろんその中でも素晴らしいものもありますが。）ただ、なぜあれほど綺麗にsingle bandが出せているのかと不思議でなりません。

semi dryでは「全く」転写されず、wet transderでなければ見えないようなall or noneのようなタンパク質ってあるんでしょうか？
　
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No.3481-6 - 2014/10/26 (日) 22:03:44 - 名無し
一応、蝉ドライは高分子量は苦手。

(無題) 削除/引用
No.3481-5 - 2014/10/26 (日) 19:03:43 - たん
Sがサ○タ○ル○なら、たまに全くworkしない時があるので、別メーカーに変えるのが早道かも。

ある抗体をS社から購入したとき（添付書にWBの反応バンド例あり）、全くバンドが検出できず、あれこれ試行錯誤してもだめで、結局メーカーを変えたらばっちり反応した事がありました。

ポジコンサンプルもあまり当てにならないし。

まぁサ○タ○ル○に限った事ではないかも知れませんが。

(無題) 削除/引用
No.3481-4 - 2014/10/25 (土) 13:06:07 - AP
私見ですが、

セミドライのほうが短時間でできて、性質の異なるタンパク質でもわりとオールマイティに転写できるけれど、効率はそこそこ、目的のタンパク質に合わせたカスタマイズがあまり自由でない。
ウェットは、タンパク質の性質によって転写効率のよいものと悪いものに分かれやすいけれど、条件にカスタマイズすることで目的のタンパク質を効率よく転写できる余地がある。

ウェットでしたら、高分子量の転写を高めるために、例えばバッファーにSDSを加えるとか、メタノールの濃度下げたりします。また目的タンパク質の等電点が極端に偏っている場合は、それを考慮してバッファーのpHを変えたります。

セミドライの場合はどの程度カスタマイズできるのかあまり知りませんが、バッファー系にいくつかバリエーションがありますね。たとえば、たしか昔、ミリポアのハンドブックか何かで見た、陽極側、中間、陰極側で異なるバッファーを使う方法なんかはよかった印象があります。

(無題) 削除/引用
No.3481-3 - 2014/10/25 (土) 09:04:13 - 転写
おお様早速ありがとうございます。
私は7% SDS-PAGEゲルで行っています。

検出は通常のパーキンエルマーのECL kitです。
研究室には他にThermoのpicoとかfemtoもあります。

そうですね、一度感度が高めのもので行ってみるべきですね。
7%なので分子量マーカー（一番大きい物で170kDa）も全て移っているようです。
一度感度高めのもので行ってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.3481-2 - 2014/10/25 (土) 08:53:01 - おお
検出用のきっとはなんでしょうか?一つ検出感度が上のキットとか使えませんか?

いろいろなことが重なってall or noneに見えることはあるかもしれません。

wetはONでできますので、高分子側のトランスファーはいくらか有利です。

トランスファーの効率を気にするなら、セミドライならゲルの濃度を6%ぐらいまで落とすといいです。

wet transferとsemi dry transferの違いについて教えてください 削除/引用
No.3481-1 - 2014/10/25 (土) 08:33:40 - 転写
140 kDaのタンパク質をwestern blottingで検出するためにPDVF膜へ転写したいです。
S社のgoatポリクロを購入して検出を試みていますが、バンドが何もでません。
この抗体の使用実績はありません。

ただし、S社のこの抗体（ロットも同じ）のページを見るとmouse brain extractでシングルバンド、しかもかなり強いシグナルが認められています。

S社に問い合わせをして、一つを除く他全ての条件を同じにしてもだめでした。
唯一違うのが、transferの仕方です。

S社からは4˚C, オーバーナイトのtransferと回答いただきましたが、私の環境にwet transferの環境がないため、semi dry式で1時間半transferしてみました。

この転写方法で、GAPDH (約40kDa) や130 kDaのタンパク質は検出できています。
やはり抗体が悪いんでしょうか。S社の抗体はみなさんご存知のように外れが多い印象です。（もちろんその中でも素晴らしいものもありますが。）ただ、なぜあれほど綺麗にsingle bandが出せているのかと不思議でなりません。

semi dryでは「全く」転写されず、wet transderでなければ見えないようなall or noneのようなタンパク質ってあるんでしょうか？
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