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(無題) 削除/引用 No.3468-6 - 2014/10/20 (月) 16:20:41 - 中年 lysate中でin vitroリン酸化反応を行うことはあまりやらないと思います。共存しているPKAなどの活性の強いキナーゼの影響が大きすぎるので。 まずIPしてよく洗っておいて、その上でキナーゼバッファーに置換してキナーゼ反応に持ち込むというのが最初の選択ではないでしょうか。キナーゼ反応の前にビーズから溶出することができればベストですが、そうでなくともビーズの上でリン酸化反応を行わせることも可能だと思います。ただし、その場合はWTとKDを区別するために、キナーゼ反応後に溶出→再IPする、WTかKDのみに大きめのタグをつけて分子量で区別できるようにする、などの工夫が必要になりますね。

(無題) 削除/引用 No.3468-5 - 2014/10/20 (月) 15:48:18 - ふとした疑問ですが 中年様 ご回答ありがとうございます。 自分で言っておいてあれですが、WTとmutantを等量混ぜてプルダウンというのは、実際（ケースバイケースだとは思いますが、一般的に言うと）どのようにやるんでしょうか。 サンプルはそれぞれtotal cell lysateだとすると37℃でin vitroリン酸化反応を見ようとするのは危険ですかね？protease inhibitorやら脱リン酸化酵素阻害剤をバンバン入れておかないと見えるものも見えないかもしれませんね。。時間もどれほどインキュベートするのが一般的なんでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.3468-4 - 2014/10/20 (月) 15:45:12 - ふとした疑問ですが おお様 ご回答ありがとうございます。 教科書ではチロシンキナーゼ型の受容体などは特に向かい合うリン酸化サイトをお互いがリン酸化し合うようなイラストが描かれていますよね。実際一分子で見た場合に分子間か、分子内でのリン酸化かどうかはそこまで重要ではなかった（レビューアーに要求されなかった）ということもあるんでしょうか。そのような論文をあまり見かけていないのでふとそう思いました。

(無題) 削除/引用 No.3468-3 - 2014/10/20 (月) 14:35:26 - 中年 キナーゼによってどちらのケースもあると思います。 判別法は、例としてあげておられるin vitroの方法の他、WTとKDを別々のタグで標識しておいて、細胞に共発現させ、別々にIPしてリン酸化レベルを比較するということでも（厳密さには欠けますが）良いように思います。

(無題) 削除/引用 No.3468-2 - 2014/10/18 (土) 09:14:55 - おお 完全な答えじゃないんですがEGFRはダイマーになって、結合した方のポリペプチドをリン酸かするモデルが出回ってたと思います。それでもautophosphorylationとよんでいるとおもいますが。どうなんでしょうかね。さいしょは区別つかなかったからでしょうかね。そうするとEGFRのautophosphorylationはintermolecularのイベントという話になるのかな。

intramolecularとintermolecularの区別 削除/引用 No.3468-1 - 2014/10/18 (土) 05:43:51 - ふとした疑問ですが 論文を読んでいてふとした疑問ですが、 あるリン酸化酵素があって、そのN末側がauto phosphorylationされることがわかっていた場合、このautoというのは、同一分子内のキナーゼドメインがリン酸化サイトをリン酸化（分子内でリン酸化, intramolecular）したということでしょうか？または近接するキナーゼによってリン酸化サイトがリン酸化されることもあるのでしょうか？（分子間リン酸化）？ Autoと聞くと自分自身をリン酸化する、と読み取れますが、実際自分自身というのは同一分子であればその分子間で働くリン酸化を指している、と考えても良いのでしょうか？論文にはその部分は明白に書かれていませんでした。 実験的にリン酸化がintramolecularなのかintermolecularで起こるのか、その判別はどうやって行えばいいんでしょうか。例えばkinase-dead mutantとWTのキナーゼを等量混ぜて、kinase-dead mutantをプルダウンして、リン酸化抗体で見たら、もしリン酸化を受けていればそれはintermolecular（隣接するWTによってリン酸化された分子間修飾）リン酸化だとわかるんでしょうか。素朴な疑問です。

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