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(無題) 削除/引用 No.3467-7 - 2014/10/19 (日) 15:58:56 - ほっぷっぷ 非特異バンドに関しては、過去には成功していたプライマーとのことなので、保存中にプライマーがヘタって特異性が下がってしまった可能性は？配列によってはすぐ駄目になってしまうものもある印象です。 ネガコンのバンドは他の方がご指摘の通りお使いのいずれかの試薬のコンタミでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3467-6 - 2014/10/18 (土) 01:11:49 - おお 非特異的であっても、一度増えたものは両端にプライまーの配列が存在するでしょうから、コンタミすると、増えてきてもおかしくはないでしょう。 PCR mixをPCRかけないでえいどうするとなんかみえますか?

(無題) 削除/引用 No.3467-5 - 2014/10/17 (金) 18:33:03 - ~ D2Wのみで増えていることが間違いないのでしたら、プライマーのみでの増幅か、コンタミでしょう。 前者ならプライマーの作り直し、後者なら汚染した試薬や器具の交換・洗浄で解決が期待できます。 どちらなのかの結論を出したいなら目的外のバンドのシークエンシングをしてみれば分かるでしょう。 ただ、常套手段としては、まずは試薬の総取り替えだと思いますが。 >プライマーは目的物を増やすように設計しているので、その特異性を超えて非特異バンドが出ている原因がわかりません… 原因を知りたいのでしたらシークエンシングをして、何が増えているのかを確認すればいいでしょう。 ここで、特異的に増える100bp短い配列のコンタミ原因の候補として ・あたりのプラスミドがデリーションしたもの ・はずれのプラスミド ・近縁種のゲノムDNA ・他の人の同じプライマーで増える異なるインサートのプラスミド ・たまたま増えた両端に使用プライマーの配列を持つ断片 ・プライマー大マーがさらに伸びて350bpにまで成長した断片 あたりを言われても、納得できませんよね。

(無題) 削除/引用 No.3467-4 - 2014/10/17 (金) 18:32:20 - seven なんにしろネガコン（水）でバンドが出るならプライマーか酵素類のどちらかが悪いわけで新しいものを買ったほうが良いとおもうのですが。悪いもの探しは労力の割に得るものが少ないので。 プライマーか酵素類のどちらが悪いかは違うプライマーでかけてそのバンドがどうなるかでわかるかもですが。

(無題) 削除/引用 No.3467-3 - 2014/10/17 (金) 17:31:27 - 誠 > 1　プライマーダイマー 350 bp付近に見られるので、ダイマーではないと考えております。 > 2　コンタミ 目的物のコンタミは真っ先に疑いました。しかし、目的物がネガコンにコンタミしている場合、目的分子量付近にバンドが見られるのではないですか？プライマーは特異性の高いものなので、コンタミしていても全く違う配列であれば増えないと思っておりました。 いずれにせよ、プライマーは目的物を増やすように設計しているので、その特異性を超えて非特異バンドが出ている原因がわかりません…

(無題) 削除/引用 No.3467-2 - 2014/10/17 (金) 17:08:51 - hu 考えられること 1　プライマーダイマー 2　コンタミ 2の場合は、チップから試薬を新しくして、ピペット内部を洗浄して、机をきれいに掃除しましょう。

[PCR]　ネガコンにバンド、目的産物以外のバンド 削除/引用 No.3467-1 - 2014/10/17 (金) 16:58:42 - 誠 いつも拝見しております。 現在PCRを行なっておりますが、2つ問題を抱えております。 １つはネガコンにバンドが出ること。 もう１つは、過去に目的産物の増幅に成功しているプライマーでPCRを行なっても、目的分子量付近よりも100 bpほど下にバンドが出ることです。 ここ最近、D2W、空ベクター、目的インサートの入ったベクターの３サンプルをPCRすると、すべてのレーンで同じ位置にバンドが検出されます。先程も申し上げましたが、目的分子量付近よりも100 bpほど下に、です。 考えられる可能性を教えていただけたら幸いです。 よろしくお願いします。

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