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(無題) 削除/引用 No.3456-22 - 2014/10/20 (月) 22:31:44 - okam >[Re:21] 774Rさんは書きました : > それから、FLAG抗体ってあんまり良い印象を持ってないのですが、感度は十分ですかね？ > 培養細胞の系で発現させたFlag付きタンパク質のサンプルのローディング量を振って、タンパク質の特異的抗体でどの程度のバンドが出た時にFlag抗体のバンドがどの程度検出出来るか見積もっておく必要はあると思います。 ありがとうございます。個人的にはFLAG抗体はよくはたらく印象でしたが、過剰発現による実験系と、こういったknock-inによるendoにおけるタグ付加では発現レベルが違うわけであり、おっしゃるとおり検討すべきかもしれません。 >[Re:18] おおさんは書きました : > >[Re:17] okamさんは書きました : > 下流の方と、あと全長の存在を確認しないとちゃんと入っているかどうかわかりませんよね。サザンやるべきじゃないかと、、、 > 複数のクローンとって全部検出されませんか? ありがとうございます。knock-inの効率がそれほど高くなく、ようやく1個得たクローンなのです。たしかにただPCR産物をチェックしただけなので、下流の方で何が起きているかは分からないですね。 皆様、色々とコメントくださりありがとうございました。総合して （１）サザンによるknock-inされたアリル全長の確認 （２）mRNAレベルでの転写の有無の確認 （３）自発的な分解が起きている可能性を考慮してのproteasome inhibitorなどの使用 （４）FLAG抗体のWBにおける反応性の確認 について進めていきたいと思います。

培養細胞系で発現確認を！ 削除/引用 No.3456-21 - 2014/10/20 (月) 12:43:17 - 774R >そのタンパク質に対する抗体で、knock-inしていないものと同等のバンドパターンが観察されたため、野生型アリルに由来する産物と考えました。FLAG導入に対するバンドシフトに関しては、分子量自体が大きいため、考察できておりません。 >MEFにCRISPR/Cas9によるエピトープタグのknock-inです。 ということは、knock-inはヘテロで入ってると考えるべきですよね？ 上記のウェスタンの確認ではknock-in由来の産物があるかどうかの確認としては不十分だと思いますよ。 編集されていない方の遺伝子に由来する産物が見えてるだけでは？ それから、FLAG抗体ってあんまり良い印象を持ってないのですが、感度は十分ですかね？ 培養細胞の系で発現させたFlag付きタンパク質のサンプルのローディング量を振って、タンパク質の特異的抗体でどの程度のバンドが出た時にFlag抗体のバンドがどの程度検出出来るか見積もっておく必要はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3456-20 - 2014/10/20 (月) 02:41:50 - yyy まあ、それならtransient transfectionで発現の有無とかFLAGタグが認識されるかどうか確認できますよね。というか、もうやってましたか？ Transient transfectionは適切な細胞さえ使えば普通は大過剰に発現されるので、こういう目的には最適だと思います。仮に、最終的に使う細胞とは別だとしても、少なくともコンストラクトに問題があって発現が無い・極端に低いという可能性は排除出来ますよね。

(無題) 削除/引用 No.3456-19 - 2014/10/20 (月) 02:34:41 - yyy そう言えばknock-inだったんですね。 何故か、stable transfectionと勝手に思っていて、CMVプロモーターとか発現ベクターのプロモーターが働くから転写は大丈夫、という前提で考えていました。

(無題) 削除/引用 No.3456-18 - 2014/10/20 (月) 01:01:35 - おお >[Re:17] okamさんは書きました : > knock-in自体は、そのタグの上流と下流150bp程度の位置に対するプライマーペアで増幅したのちにシークエンスを確認しております。 下流の方と、あと全長の存在を確認しないとちゃんと入っているかどうかわかりませんよね。サザンやるべきじゃないかと、、、 複数のクローンとって全部検出されませんか?

(無題) 削除/引用 No.3456-17 - 2014/10/19 (日) 23:02:12 - okam >[Re:16] Harmoniaさんは書きました : > > そのタンパク質に対する抗体で、knock-inしていないものと同等のバンド > > パターンが観察されたため、野生型アリルに由来する産物と考えました。 > > 思ったように翻訳され、FLAGがつながったままだと、特異的抗体で免沈して > FLAG抗体で検出できますよね？できないなら、思ったように翻訳されてないか、 > 切れてるか、FLAGのエピトープが隠されてるか？ > > ところで、 > knock-inしたホストは何？ 2n? 多倍体？ > knock-inしたのはタグのみ？ cDNA? genomic DNA? > knock-inしたのは１アリルのみですよね？両アリルともknock-inはできる？ > knock-inできているの？ > （エピトープタグの挿入自体は該当領域のgenome PCRの具体的プライマー位置は？） > 転写されてるの？RT-PCRでFLAGは入っているの？ > 特異抗体は信頼できるの？ ありがとうございます。特異的抗体による免疫沈降効率がよくないため、考えておりませんでした。 FLAG抗体による免沈では、その後のFLAG抗体によるWBでも検出されませんでした。 MEFにCRISPR/Cas9によるエピトープタグのknock-inです。 MEFは長期間培養しており、多倍体である可能性があります。 knock-inはCRISPR/Cas9の効率から1アリルと推測されます。 knock-in自体は、そのタグの上流と下流150bp程度の位置に対するプライマーペアで増幅したのちにシークエンスを確認しております。特異抗体自体は タンパクレベルで発現が見られないという細胞株に対して検出されず、発現が見られるというものでその分子量のところにバンドが検出される程度で、働いていると考えております。 おっしゃるとおり、転写レベルでの確認は必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.3456-16 - 2014/10/18 (土) 15:59:51 - Harmonia > そのタンパク質に対する抗体で、knock-inしていないものと同等のバンド > パターンが観察されたため、野生型アリルに由来する産物と考えました。 思ったように翻訳され、FLAGがつながったままだと、特異的抗体で免沈して FLAG抗体で検出できますよね？できないなら、思ったように翻訳されてないか、 切れてるか、FLAGのエピトープが隠されてるか？ ところで、 knock-inしたホストは何？ 2n? 多倍体？ knock-inしたのはタグのみ？ cDNA? genomic DNA? knock-inしたのは１アリルのみですよね？両アリルともknock-inはできる？ knock-inできているの？ （エピトープタグの挿入自体は該当領域のgenome PCRの具体的プライマー位置は？） 転写されてるの？RT-PCRでFLAGは入っているの？ 特異抗体は信頼できるの？

(無題) 削除/引用 No.3456-15 - 2014/10/18 (土) 08:33:52 - yyy >[Re:13] okamさんは書きました : > 細胞質タンパク質ですが、部分的に分解される可能性があると考えております。WBでSDSによる変性を受けていても、なお、立体構造による影響の可能性があるのですか？考慮に入れていなかったので、FLAGタグを切らないプロテアーゼで切断してみることも考えます。 > > PVDF膜上でもタンパクはnativeではなくとも何らかの構造をとってると思いますが。自分が扱ったタンパクではFLAGタグの比較的近くにジスルフィド架橋があったり、疎水性の強い部分が近くにあってタグの運動の自由度がある程度制限されただろうせいもあるかもしれませんけどね。 細胞質タンパクということはN末のシグナル配列とかに気を遣う必要も無さそうですね。既に指摘されてるように、2番めのコドンも重要だと思うのでタグの位置をすこしC末側にずらすとか、First Metとタグの間にAlaを挿入するとか試す価値はあるような気はします。 分解の可能性があるならProteasome阻害剤とかシステインプロテアーゼ阻害剤を試すとか。分解産物がimmunoblotで見えなかったということですが、分解産物が小さい上に疎水性が低かったりするとPVDF膜に着く効率が低いので検出できない、という可能性もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3456-14 - 2014/10/18 (土) 01:47:09 - おお ミトコンドリアにいってましたっていうおちは、、、たぶんないですね。しつれいしました。

(無題) 削除/引用 No.3456-13 - 2014/10/18 (土) 01:30:41 - okam >[Re:12] yyyさんは書きました : > シグナル配列や膜貫通配列の「可能性があると思います」という答えでは状況が理解出来ません。そのタンパクは分泌or膜タンパクなのでしょうか？　それとも細胞質タンパクなのでしょうか？　それだけでも有用な情報になると思います。 > FLAGタグの抗体による検出は個人的には前後の配列とか、タンパクの立体構造による影響を受けやすい印象をもっています。以前に、FLAGタグをつけた全長タンパクではFLAG抗体で弱くしか検出されないのが、プロテアーゼで切った産物では非常に強く検出されたことがありました。 yyyさん、ありがとうございます。 細胞質タンパク質ですが、部分的に分解される可能性があると考えております。WBでSDSによる変性を受けていても、なお、立体構造による影響の可能性があるのですか？考慮に入れていなかったので、FLAGタグを切らないプロテアーゼで切断してみることも考えます。

(無題) 削除/引用 No.3456-12 - 2014/10/17 (金) 23:03:38 - yyy シグナル配列や膜貫通配列の「可能性があると思います」という答えでは状況が理解出来ません。そのタンパクは分泌or膜タンパクなのでしょうか？　それとも細胞質タンパクなのでしょうか？　それだけでも有用な情報になると思います。 多くの分泌or膜タンパクはシグナル配列を持つし、シグナル配列が切られた後は速やかに分解されるだろうから検出はかなり困難だろうし、FLAGタグがシグナル配列がSRPに認識されるのを阻害するような場合にはタンパク自体がProteasomeなどに速やかに分解される可能性もあるのでは？ その可能性があるとしたら、試しにProteasome阻害剤を入れて検出を試みるのも一つの手かと。もっとも、その後に予定してた実験には使い物にならないでしょうが。 FLAGタグの抗体による検出は個人的には前後の配列とか、タンパクの立体構造による影響を受けやすい印象をもっています。以前に、FLAGタグをつけた全長タンパクではFLAG抗体で弱くしか検出されないのが、プロテアーゼで切った産物では非常に強く検出されたことがありました。 試しに、トリプシンとかキモトリプシンはFLAGタグを切ってしまうので使えないでしょうが、手元にFLAGタグを切らないプロテアーゼがあったら試してみるのも良いかと。

(無題) 削除/引用 No.3456-11 - 2014/10/17 (金) 22:28:51 - okam 皆様、多数のコメントありがとうございます。 >[Re:9] Harmoniaさんは書きました : > 近頃は「レティキュロサイトの翻訳キット」で確認ってしないんですか？ > 余計に金がかかるかもしれないけど、生き物に入れて何だかわからない > 理由でうまくいかない、ともやもやしているなら、経済的かと。 そのようなキットは存じあげませんでした。調べてみます。 >[Re:8] APさんは書きました : > 元の遺伝子のKozak配列を生かして、そこにタグの開始メチオニンコドンをはめ込んだということでしょうか。Kozakが生きているとして、それに続く開始コドンATGの次の塩基は何になっていますか。 その通りです。元の遺伝子のKozak配列を利用いたしました。 CC ATG GAC-となっております。 >[Re:5] huさんは書きました : > もちろん確認済みだと思うのですが、シグナルペプチドやプレドメインの切断の可能性は？ 報告はされておりませんが、可能性はあるかと思います。たとえ切断されても、エピトープ自体が完全に分解されなければ、メンブレン上どこかで検出できると考え、gradient gelにて確認（10kDa以上）したのですが、検出できなかったのです。 >[Re:3] 774Rさんは書きました : > それから、質問者に確認したいのですが、タグ抗体で反応が出ないとしても、そのタンパク質に対する抗体を使って、発現自体は上手く行ってることは確認済みなのでしょうか？ > それがないと、翻訳でタグの先頭から行ってるかどうかを検討することも出来ないように思います。 そのタンパク質に対する抗体で、knock-inしていないものと同等のバンドパターンが観察されたため、野生型アリルに由来する産物と考えました。FLAG導入に対するバンドシフトに関しては、分子量自体が大きいため、考察できておりません。 >[Re:2] おおさんは書きました : > tagに対しての抗体はポジコンを同時に流しましたでしょうか? FLAG抗体なのですが、それはワークしているようです

(無題) 削除/引用 No.3456-10 - 2014/10/17 (金) 21:27:51 - つーか 質問しっぱなしで、指摘されたことに何も答えない最低な質問者だな。

(無題) 削除/引用 No.3456-9 - 2014/10/16 (木) 07:53:56 - Harmonia 近頃は「レティキュロサイトの翻訳キット」で確認ってしないんですか？ 余計に金がかかるかもしれないけど、生き物に入れて何だかわからない 理由でうまくいかない、ともやもやしているなら、経済的かと。

(無題) 削除/引用 No.3456-8 - 2014/10/15 (水) 19:37:34 - AP 元の遺伝子のKozak配列を生かして、そこにタグの開始メチオニンコドンをはめ込んだということでしょうか。もしKozakを崩すような形で入れたなら、翻訳効率が著しく下がるでしょう。 Kozakが生きているとして、それに続く開始コドンATGの次の塩基は何になっていますか。ATGの次の塩基はプリンとくにGに著しい好みがみられます（ピリミジンであることは、おそらく数%で例外的）。どの程度影響するのかは知りませんが、ATGRになるようにデザインするのが安心だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3456-7 - 2014/10/15 (水) 18:19:42 - おお たしかにNcoI 認識配列はstart codonのところによく使われますね。 あるいはそのターゲットの遺伝子のstart codonの直後にtagを入れると遺伝子の従来のstart codon認識とおなじ機構で始まってくれる可能性があると思います。タグの後にMがひつようであればその部分はコザック様配列にならないようにチェックした方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3456-6 - 2014/10/15 (水) 17:42:11 - 名無し kozak配列 CCATGG とかよくつかってたな。（ATG＝開始コドン）

(無題) 削除/引用 No.3456-5 - 2014/10/15 (水) 08:49:49 - hu もちろん確認済みだと思うのですが、シグナルペプチドやプレドメインの切断の可能性は？

(無題) 削除/引用 No.3456-4 - 2014/10/15 (水) 00:14:12 - おお ああ、大腸菌かと思ってました。ゲノムPCR、ノックインとかいてるので、しんかく生物のほうがつじつまがあいますね。。。そうならコザック配列の方を考えるべきですね。

真核生物でもSD配列が機能する？ 削除/引用 No.3456-3 - 2014/10/14 (火) 21:39:22 - 774R >SD配列から10ベースぐらい離れてATGがあると効率がいい knock-inの話をしてるので、真核生物（たぶんマウス）での発現だと思われますが、SD配列も真核生物でそのような機能があるのですか？？ 基本的にはkozak配列であることと、firstメチオニンであることが翻訳開始の条件だと思ってますが。 それから、質問者に確認したいのですが、タグ抗体で反応が出ないとしても、そのタンパク質に対する抗体を使って、発現自体は上手く行ってることは確認済みなのでしょうか？ それがないと、翻訳でタグの先頭から行ってるかどうかを検討することも出来ないように思います。 knock-inですので、そのプロモーターの活性が低い場合、発現量自体が少なすぎてタグ抗体で反応が出ない可能性も考えられますので・・・

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