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(無題) 削除/引用 No.3454-12 - 2014/10/16 (木) 23:52:47 - KtR バックアップで仕込んでおいた2回目の実験で、 50クローン拾ってなんとか2個ほど目的としていた レポーターノックインアリル＋まともなWTアリルのヘテロノックイン株を 取得することが出来ました。 まだ他に何種類か作りたいノックイン株がありますので、 皆様のご意見を参考にプロトコルを改良してみます。 ご協力誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3454-11 - 2014/10/15 (水) 14:32:45 - asan ESやハップロイド培養細胞以外のがん細胞の場合は、染色体数が複数ある可能性があるため、難しいですが、ESの場合は論文的には結構高効率で成功していますね。ただ、がん細胞でもできないことはないです。 1. ターゲッティングベクターにセレクションマーカーを含むカセットをいれるか。通常セレクションマーカーを含んでいれば50%とはいかなくても1/10ぐらいの割合でホモはとれるとおもいます。この場合はCreで後で除く必要が有りますが効率は悪くなさそうです。もちろんノックインされた後は切れなくなるようにするのと、ランダムインテグレーションをはじく必要性はあります。 2. Amaxa等Nucleofectionでやる。Fugene等でも入る場合もあるみたいですが、Knock in に関してはなぜかNucleofectionの方が圧倒的に効率がいいみたいです。 3. Nickaseの使用については、当初の結果とは違って今ではWT Cas9に比べて効率が悪いということが言われていますので、iPSということを考えると使いづらい可能性があります。 4. 一応GFPのノックインによって構造変化などで致死になっていないことはあらかじめ確かなのか。N末やC末のが削れる程度で問題なくても、大きなタンパク質がつくことによって影響がある可能性があります。 5. 　iPSで発現しているならば、GFPの発現量を指標にそのままソーティングするというのはできないかどうか。ホモで入った場合の方がGFPの発現が若干高いことを期待する。そこまでいかなくても、入ったクローンだけをセレクションすれば良いならばもっと多くクローンを確認できるので、1つぐらいは見つかるかもしれない。 iPSについては、導入効率の問題もあるので最近Cell Stem Cellsにでてた論文のように、一度Cas9をDox誘導システムにしたラインを樹立した上で、gRNAをmRNAで入れる方法がより効率がいいみたいです。ま、クローンがとれていない訳ではないのでこの場合ちょっとちがいますが。

(無題) 削除/引用 No.3454-10 - 2014/10/15 (水) 07:06:42 - 中西部ポスドク http://www.addgene.org/CRISPR/nick/ nickkaseはここで入手可能です。

(無題) 削除/引用 No.3454-9 - 2014/10/14 (火) 21:46:01 - KtR >[Re:8] ossiさんは書きました : > WTに変異が入ったヘテロノックインが取れてくるのは、片方でGFPのHRが起こって、もう片方でNHEJが起こっているからですよね? > > KtRさんが使ってるインビトロジェンのキットがどういうものかわからないのですが、Cas9ヌクレアーゼではなく、Cas9ニッカーゼを使うのではどうですか? > もしダブルニッカーゼでやってるなら、シングルにするとか。 > 効率が下がってしまうとは思いますが… 使っているのはこちらのキットになります。 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A21174 コードしているCas9にポイントミューテーションを入れてD10A変異体にしたら、 ニッカーゼになりますか？もう少し調べてみたいと思います。 > あとは、ターゲッティングベクターをGFP有りと無しの2種類同時に混ぜるとか。 > 上手く行けば、GFP有りと無しが片方ずつノックインされた、見た目がヘテロだけど実際には両アリルがHRでノックインされたコロニーが取れるかもしれません。 標的部位を中心にゲノムから2000bpほどクローニングしてきて、 gRNA認識配列+PAMにサイレント変異を導入したあと一緒に入れてみます。 > ちなみに、後学のために教えて頂けると嬉しいのですが、ホモロジーアームは何bpくらいですか? 5'arm 1.5kbp、3'arm 1kbpを目安に作成しています。 シグマのZFNのプロトコルでは、最低500bp、750bp以上を推奨となっていましたので、 少し余裕を見てこの値にしています。 >[Re:7] おおさんは書きました : > alternative スプライシングなどgenomeでコードされているCDS以外の制御も気になりますからね。 > > >一つ追加で思いついた対策ですが、DNA-PKcs/Ku70/Ku80あたりのsiRNAを > 同時にトランスフェクションして、NHEJを阻害してやればWT側の変異を抑制できないでしょうか？ > > 面白い試みですね。やってみないとわからないでしょうけど。ただあまりにも押さえ込むと目的のものが入らないとか、、、 > > ノックインする領域のWTアレルの配列をダミーとして同時にtransfectionするとか、、、そうするとWTアレルにうまくWTが挿入されたり、いくらかダミーをターゲットにしてcompetitionがかかるとか、、、ごめんなさい想像の範囲です。これも極度にやると入れたいものの挿入が怪しくなってくるかもしれません。 ご意見誠にありがとうございます。大変参考になります。 道具作りに熱中し過ぎるとボスのカミナリがおっかないですが、 スマートな解決策がないかもう少し頭を使ってみます。

(無題) 削除/引用 No.3454-8 - 2014/10/14 (火) 10:58:28 - ossi WTに変異が入ったヘテロノックインが取れてくるのは、片方でGFPのHRが起こって、もう片方でNHEJが起こっているからですよね? KtRさんが使ってるインビトロジェンのキットがどういうものかわからないのですが、Cas9ヌクレアーゼではなく、Cas9ニッカーゼを使うのではどうですか? もしダブルニッカーゼでやってるなら、シングルにするとか。 効率が下がってしまうとは思いますが… あとは、ターゲッティングベクターをGFP有りと無しの2種類同時に混ぜるとか。 上手く行けば、GFP有りと無しが片方ずつノックインされた、見た目がヘテロだけど実際には両アリルがHRでノックインされたコロニーが取れるかもしれません。 ちなみに、後学のために教えて頂けると嬉しいのですが、ホモロジーアームは何bpくらいですか?

(無題) 削除/引用 No.3454-7 - 2014/10/13 (月) 23:56:34 - おお alternative スプライシングなどgenomeでコードされているCDS以外の制御も気になりますからね。 >一つ追加で思いついた対策ですが、DNA-PKcs/Ku70/Ku80あたりのsiRNAを 同時にトランスフェクションして、NHEJを阻害してやればWT側の変異を抑制できないでしょうか？ 面白い試みですね。やってみないとわからないでしょうけど。ただあまりにも押さえ込むと目的のものが入らないとか、、、 ノックインする領域のWTアレルの配列をダミーとして同時にtransfectionするとか、、、そうするとWTアレルにうまくWTが挿入されたり、いくらかダミーをターゲットにしてcompetitionがかかるとか、、、ごめんなさい想像の範囲です。これも極度にやると入れたいものの挿入が怪しくなってくるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3454-6 - 2014/10/13 (月) 23:21:29 - KtR >[Re:5] おおさんは書きました : > 独り言さんのコメントをみて、一方の染色体にはWTが発現する抗生物質マーカーラベルの入ったコンストラクトを入れてしまうというのはアイデアかなぁ。。。でもなるだけ余分なものは入れたくないですね。たしかに。 おっしゃるように、なるべくならWT側は弄りたくないと思っています。 が、うまくいかない場合は標的遺伝子のCDS+IRESないし2A+GFPのコンストラクトも考えています。 40コロニーほどピックアップして、未分化から逸脱したコロニーが4、ハズレが12、ホモのノックインが9、 残りがWTに変異の入ったヘテロのノックインでした。 コンストラクトを変更せずひたすら数をこなすのとどちらが良いか思案中です。 一つ追加で思いついた対策ですが、DNA-PKcs/Ku70/Ku80あたりのsiRNAを 同時にトランスフェクションして、NHEJを阻害してやればWT側の変異を抑制できないでしょうか？ 引き続き、皆様のご意見や経験談等よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3454-5 - 2014/10/13 (月) 03:15:34 - おお 独り言さんのコメントをみて、一方の染色体にはWTが発現する抗生物質マーカーラベルの入ったコンストラクトを入れてしまうというのはアイデアかなぁ。。。でもなるだけ余分なものは入れたくないですね。たしかに。

(無題) 削除/引用 No.3454-4 - 2014/10/12 (日) 20:43:38 - KtR >[Re:3] 独り言さんは書きました : > やったことはないですが、用いているテンプレートベクターは一種類なんですよね？そもそも両アレルを効率的にノックインすることはできるんですかね。 > > 別々の薬剤耐性を入れたテンプレートベクター（片方はネオマイシン、片方はピューロマイシンとか）にして、crispr後にダブるセレクションすれば両アレルともノックインになったものがとれるのではないでしょうか。 説明が足りず申し訳ございません。 必要なのはノックインアリル＋まともなWTアリルを持ったヘテロノックイン株になります。 分化に関わる転写因子を標的にしておりますので、 ノックアウトしてしまうとおそらく未分化iPS細胞から 目的細胞へまともに分化しなくなるかと考えております。 >[Re:2] おおさんは書きました : > うーんよわりましたね。。。確かにプラスミドの量を減らして効率を下げるのは考えられる手ですが。 > > と経験がないながらに想像しています。いっそうのことそのdeletionが入ったところをそのalleleスペシフィックなCRISPR/Cas9をつくって戻してやった方がと思ったりも、、、 > ありがとうございます。 まずCRISPRプラスミド量を幾つか条件をふってトランスフェクションし、 それでうまくいかない場合は遺伝病の遺伝子修復のプロトコルを参考に レスキューをかけてみます。

(無題) 削除/引用 No.3454-3 - 2014/10/12 (日) 15:53:14 - 独り言 やったことはないですが、用いているテンプレートベクターは一種類なんですよね？そもそも両アレルを効率的にノックインすることはできるんですかね。 別々の薬剤耐性を入れたテンプレートベクター（片方はネオマイシン、片方はピューロマイシンとか）にして、crispr後にダブるセレクションすれば両アレルともノックインになったものがとれるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3454-2 - 2014/10/12 (日) 14:58:08 - おお うーんよわりましたね。。。確かにプラスミドの量を減らして効率を下げるのは考えられる手ですが。 と経験がないながらに想像しています。いっそうのことそのdeletionが入ったところをそのalleleスペシフィックなCRISPR/Cas9をつくって戻してやった方がと思ったりも、、、

CRISPR/Cas9システムを用いたノックイン細胞株樹立 削除/引用 No.3454-1 - 2014/10/12 (日) 04:39:39 - KtR お世話になります。 現在、インビトロジェンのAll in one発現ベクターのCRISPRを用いたヒトiPS細胞株の GFPレポーターノックイン組み換え細胞株の樹立を行っております。 標的遺伝子へのヘテロのノックインはPCRで確認できたのですが、 WTのアリル側にもデリーション等の変異が入った株しか取れず困っています。 自分で考えた対策としては、 1.トランスフェクションで導入するCRISPR発現プラスミド量を減らす 2.プラスミドではなくシグマ等で販売しているmRNAをトランスフェクションする 3.CRISPR標的配列にアミノ酸置換の起きない変異を導入したWTの配列も一緒にトランスフェクションする。 程度ですが、他に良い対策はありますか。 よろしくお願いいたします。

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