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(無題) 削除/引用 No.3450-5 - 2014/10/10 (金) 15:47:05 - AP 遺伝子導入（transfectionやtransgenesis、あるいは大腸菌をトランスフォームしてからのタンパク質大量発現)をするために新たに作ったコンストラクトは、完成したら少なくとも目的遺伝子の配列は全長読むべきです。 PCRの発明前、つねに大腸菌で増やしたDNA断片でコンストラクトを作っていた頃だって、まれに完成したコンストラクトにエラーが見つかることはありました。それを確認せずに遺伝子導入体を作って手間隙かけていろいろ実験した挙句、エラーが入っていたためファンクショナルではありませんでした、アーティファクトでした、なんてことになったらどーする？

(無題) 削除/引用 No.3450-4 - 2014/10/10 (金) 14:01:56 - おお その変異させる前後でうまいこといい制限酵素認識部位があれば、その制限酵素認識部位をカバーする部分を読んで、変異が入っていたらそこを切り取り、変異の入ってないオリジナルのベクターへswapするといいかと

(無題) 削除/引用 No.3450-3 - 2014/10/10 (金) 14:00:18 - 独り言 fidelityの高いpcrなら20サイクルぐらいではめったにエラーははいらないので、目的部分しかシークエンスしてません。少なくとも私は。 でもquick changeのキットはPCRではなかったとは、知りませんでした。ならばそもそも気にする必要がないのでは。

(無題) 削除/引用 No.3450-2 - 2014/10/10 (金) 10:41:36 - TS 目的遺伝子のシークエンス確認は必須と思います。 ポリメラーゼで伸ばしているだけですから、どこにエラーが入るわかりませんので。 発現すればよいということであれば、 バックボーンの部分については必須ではない場合もある思いますが、 実験目的によると思います。

Quick change mutagenesis時の全長シークエンスの必要性 削除/引用 No.3450-1 - 2014/10/10 (金) 10:36:00 - AIM いつも参考にさせていただいております。この度stratageneのquick change mutagensis kitを使って、点変異を導入しようとしています。このキットは非PCRでmutantを作製するため望んだ部分の他には変異が入りにくいとありました。 私の興味ある遺伝子は3000ntほどで、その全長をシークエンスで確認する必要がありますでしょうか？あるいは変異を入れた部分だけを読めばそれですましても良いものでしょうか。いずれにしてもベクターの全長を読む予定はありませんので、望んだ変異は入っていない、という前提で、変異を入れた部分だけを読んでもいいのではと思っていますが、その辺りの慣例がわかりません。インサートを切り出して、元のベクターに入れるということも考えていますが、insert入りのベクターは購入したもので、制限酵素がレアなものが使用されているため、わざわざこのために制限酵素を２種買うのも躊躇われます。ご意見いただけますと幸いです。

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