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(無題) 削除/引用 No.3438-11 - 2014/10/11 (土) 07:00:57 - ~ Can Ge tSignal既出でしたね、失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.3438-10 - 2014/10/11 (土) 06:59:02 - ~ toyoboのまわし者ではありませんが、困ったときのCan Geはt Signalはいかがでしょう？抗体にもよりますが、劇的に改善することもあります。

感謝 削除/引用 No.3438-9 - 2014/10/10 (金) 22:17:55 - 尾も白い みなさまどうもありがとうございました。 来週あらためてSDS-PAGEよりやり直してみます。 本当に丁寧にご返事いただきとてもうれしかったです。

(無題) 削除/引用 No.3438-8 - 2014/10/09 (木) 09:02:31 - PAR子 CSTさんが書いてくださったのと同じになりますが・・・ 私もふだんは直接SDSバッファーに溶かしますが、1% NP40のバッファーで抽出してWBしたこともあります。 15ug程度でちゃんと見えたので、10ugでもたぶんいけると思います。 増やせるならもうちょっと増やしたほうが見やすいと思いますが。 サンプルの抽出があやしいなら、そのサンプルで何か他の核タンパクのWBをやってみては？ 20-30あたりのバンドって、PARPが切れたときのN末の短いほうのことでしょうか？ 私がPARPをみるときは、やわらかめのゲルで流してFLとcleavedのC末(89k)をみるので、20-30k付近に出るか試したことはないです。 #9542のデータシートを見ると、抗原はcleavage siteとなっていてポリクロなので、もしかしたら両方に反応するのかもしれませんが。 アブカムのは、抗原がN末でFLとcleavedのN末側に反応するんじゃないでしょうか。 >PARP-1はcaspase以外の酵素でも切断されるので、薬剤によっては異なるサイズのpuroductが出るかもしれませんし、 私も聞いたことがありますが、何かの条件で50kあたりに出るとか・・・　 このPARP抗体に関してはスキムミルクでまったく問題ないのですが、スキムミルクやBSAを使ってバックが高くて目的のものが弱くて見えづらいときは、東洋紡のPVDF Blocking Reagent for Can Get Signalというのを試すことにしています。 これとCan Get Signalをあわせて使うとかなり改善されることが多いです。 コストはかかりますけど・・・ このブロッキング剤の成分は非タンパクの合成ポリマーなので、おおさんの書かれているのと同じようなものなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3438-7 - 2014/10/09 (木) 03:18:34 - おお ブロッキングでバックを落とすなら、PVP-40は場合によってかなり有効です。ただ抗体によってはシグナルがかなり弱くなる可能性もあります。BSAやミルクとコンビネーションでつかっても大丈夫です。単独なら0.5%以上3%ぐらいまであげることもあるようです。コンビネーションなら0.1%でもかなり改善が見られることがあります。 PVP-40はたとえばターゲットがわからない自己抗体でWBして検出された部分の蛋白をMSで分析するといったときに使われたりします。蛋白性のブロッキング剤ではMSのバックグランドがたかすぎるので。 ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269783710687 ttp://www.enzolifesciences.com/ALX-804-162/phosphoserine-mab-1c8/ Recommended blocking buffer BPPT: 2x PBS containing 3% (w/v) BSA, 1% (w/v) PEG 4,000, 1% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP), 0.1% (v/v) Tween 20. Do not use milk/casein for blocking and dilution!

感謝 削除/引用 No.3438-6 - 2014/10/09 (木) 01:43:21 - 尾も白い 皆様　ありがとうございました。 丁寧にご返事をいただき本当に安心しました。 MILKをつかってブロッキングしてやってみます。

(無題) 削除/引用 No.3438-5 - 2014/10/08 (水) 13:46:48 - CST 私もCST#9542を使っており、FLとcaspaseによるcleaved productがメインで検出されます。ただ、マウスから単離した単球系の細胞を用いた時はFL含め全く検出できませんでした。お使いの細胞でのPARP-1の発現は文献などで確認されてますでしょうか？（メラノーマの細胞株であれば発現しているとは思いますが、、、） ブロッキングは3%スキムミルクで、タンパク抽出は直接SDSバッファーに溶かしてます。通常20ug流してますが、発現している細胞であれば10ugでも十分行けそうな感じに見えます。自分で確認した事はないのですが、同僚が核抽出後RIPAで溶かした分画でPARP-1のウエスタンをやっていて、少なくともFLはRIPAで溶出できるようです。 PARP-1はcaspase以外の酵素でも切断されるので、薬剤によっては異なるサイズのpuroductが出るかもしれませんし、異なるサイズのproductがこの抗体で認識されればラダーのようになるかもしれませんね。おおさんもおっしゃられてますが、取りあえず薬剤処理していない状態でFLがきちんと見えるかどうかが大事と思います。

お教え願います。 削除/引用 No.3438-4 - 2014/10/08 (水) 09:31:27 - 尾も白い PAR子 様　ありがとうございます もうひとつうかがいたいのですが 実験系にもよると思いますが、検体量がたくさんいるのでしょうか？ PARPは細胞のタンパク量10ugであればバンドが弱く出るものでしょうか？ しつこく聞いてすいません。 もしよろしければお教えねがいます。 PARPの別の抗体でabcamでは20-30あたりにもバンドが出てしまうみたいにwebでみたんですがそんなことありますか　CSTでは？

(無題) 削除/引用 No.3438-3 - 2014/10/08 (水) 09:16:41 - PAR子 CSTの#9542を使ってます。 少しバックは出ますが、FLとcleavedの位置に出るバンドに比べれば問題ない程度です。 CST#9542の推奨プロトコールではブロッキング、一次抗体ともにスキムミルクですので、BSAではなくスキムミルクでやってみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3438-2 - 2014/10/07 (火) 06:21:46 - おお まず誘導してないコントロールで目的のバンドは確認できるのでしょうか?2次抗体だけでそのバンドはでますか?

PARPのWB 削除/引用 No.3438-1 - 2014/10/07 (火) 02:56:21 - 尾も白い いつも参考にさせていただいております。 　薬剤の細胞障害において、アポトーシスの指標としてPARPをWBで示そうとしております。CSTの＃9542のPARP（cleavedとfull両方）の抗体を使っていますが、うまくいきません。複数のバンドが出てしまい、BACK GROUNDがうまく処理できていないのかもしれない（3％BSA+TTBS ブロッキング)のと、実際に目的のバンドも薄くしかでません。RIPA buffer（25mM Tris•HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS）で細胞をとかしております（sonicateなし）。細胞はメラノーマの細胞株を使っています。 　核内タンパクがとれていないのでしょうか？ 　PARPが修飾されてしまっているのでしょうか？ 　total protein 10ugをゲルに流しているのですが少ないのでしょうか？ 　staurosporineで処理したものをpositiveコントロールに次はおいて見ますが、他に何か手立てがありますか？ 　詳しい方お教えいただければ幸いです。

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