全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3432-15 - 2014/10/13 (月) 07:16:13 - ふじお Profinity eXact™ Fusion-Tag システムというのがBioradより出ています。 参考になれば幸いです。以下使用例もあります。 http://www.nature.com/ncomms/2013/131009/ncomms3529/full/ncomms3529.html

(無題) 削除/引用 No.3432-14 - 2014/10/06 (月) 09:43:57 - おお あ、N-S acyl rearrangementの部分だけ見てました。 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.3432-13 - 2014/10/06 (月) 06:24:43 - papa インテイン発現系ですが， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC147948/ をご確認いただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.3432-12 - 2014/10/06 (月) 04:12:19 - おお >[Re:9] Pierさんは書きました : > おお様 > ＞生理的な状態でその蛋白はN末端にグルタミンを露出しているのでしょうか?それならそのメカニズムを使うのもてかもしれませんよ。 > > これはシグナル配列を付けた状態で発現させるということでしょうか？ > 真確生物の分泌シグナルは大腸菌内で除去されるでしょうか？ > いや、このケースなら真核生物をつかってはどうかということです。ただ、mgオーダーはまんまるの培養細胞では結構きついかもしれません。 イーストでオリジナルの配列で分泌されるようであればPichiaをつかって、プラスミドの分泌系を使わず発現させるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3432-11 - 2014/10/06 (月) 04:02:48 - おお >[Re:10] papaさんは書きました : > 大腸菌のペリプラズム分泌系で量は稼げないないと思います。 > IMPACT systemなどのインテイン融合発現系で細胞内発現はどうでしょうか。 使用の前に確認して欲しいのですが、N-末を露出したいときは、N末にCysが必要で、それが残るのではなかったかと。。。

(無題) 削除/引用 No.3432-10 - 2014/10/05 (日) 18:45:02 - papa 大腸菌のペリプラズム分泌系で量は稼げないないと思います。 IMPACT systemなどのインテイン融合発現系で細胞内発現はどうでしょうか。 インテインN末融合で切断箇所直下流からGlnになるようInfusion systemなどで直に導入してみては。ベクターもPCRで増幅して。 封入体でもいいようなので。

情報ありがとうございます。 削除/引用 No.3432-9 - 2014/10/05 (日) 17:42:48 - Pier 皆様情報ありがとうございます。 説明がわかりにくい部分があり申し訳ありません。 目的タンパク質は、 天然ではN末端に分泌シグナルが付加されており、 発現後にそのシグナル配列が除去され、成熟タンパク質のN末はグルタミンになるものです。 大腸菌に発現させるために、シグナル配列を除いたcDNAを用いています。 今まではpelB配列の直後にその配列が入るようにし、 大腸菌内でpelB配列が除去され、N末端がグルタミンになる成熟体の回収を目標としましたが、発現が低く困っています。 これまでに、レアコドンを問題を解決すべく、Rosseta系も用いましたが、発現は向上できず、 その後cDNA 配列もコドン最適化したものを用意し(同様にpelB配列後に挿入したもの）、試しましたが、向上できませんでした。 今まで使用した大腸菌株は BL21(DE3), BL21(DE3) pLys S, Rosseta-gami(DE3), Rosseta-gami(DE3)pLysSです。発現が一番良いのはBL21(DE3) pLys Sでしたが、それでも回収量が低いです。 目的タンパク質が大腸菌に対して毒性がある可能性があります。 （実際にはわからないのですが、目的配列を含むベクターの安定性は低いようです） 温度などの発現条件はかなり検討しましたが、最良の物でも発現量が少ないです。 発現系を変えようかと思い（N末端を他のタグ配列にし、精製後に酵素処理で除くなどの） 今回質問したしだいです。 できればC末端にも余計な配列は付加したくありません。 現在の系（pelB配列を用いたもの）では可溶性でN末がグルタミンのものがとれていますが、量が少ないです。 発現量が少ないというのは、回収量が数百ug/1L培養程度で、できればmgオーダー/１L培養程度欲しいです。 おお様 ＞生理的な状態でその蛋白はN末端にグルタミンを露出しているのでしょうか?それならそのメカニズムを使うのもてかもしれませんよ。 これはシグナル配列を付けた状態で発現させるということでしょうか？ 真確生物の分泌シグナルは大腸菌内で除去されるでしょうか？ 以上よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3432-8 - 2014/10/05 (日) 12:16:16 - pe 勘違いしてました。 発現した後にプロセスされてN末がグルタミンになるということですね。 シグナルペプチドの切断か、Furin系の酵素による切断でしょうか。 Factor Xaの効率に関してはわかりませんが、HisやGSTをN末につけて、精製した後に切断、再度精製してカラムに結合しないものを拾ってくるのがよく用いられる手法だと思います。C末に別のタグをつけておけば、酵素の除去も容易です。

(無題) 削除/引用 No.3432-7 - 2014/10/05 (日) 10:28:30 - cDNA 私自身はまだまともに使ったことはありませんが、SUMOをタグとしたベクターが複数社から販売されています。N末にプロリンだけは無理なようですが、グルタミンならどこのものでも大丈夫なようです。 経験談ではないので、一つの情報と思ってください。

(無題) 削除/引用 No.3432-6 - 2014/10/05 (日) 08:18:23 - pe 大腸菌株の記載がありませんが、単にレアコドンの問題では？ また、N末にタグがつくのを嫌うなら、タグをC末につけてはだめでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3432-5 - 2014/10/05 (日) 03:55:15 - おお 生理的な状態でその蛋白はN末端にグルタミンを露出しているのでしょうか?それならそのメカニズムを使うのもてかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3432-4 - 2014/10/05 (日) 03:51:30 - おお うまくやらないとバリエーションができてしまうかもしれませんがpPICZαをつかったPichiaを使ったシステムがあります。 http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/easyselect_man.pdf

訂正 削除/引用 No.3432-3 - 2014/10/05 (日) 01:21:52 - yyy 勘違いしてましたが、Factor Xaも認識配列　lle-Glu-Gly-Arg　のC末で切るようですね。Thrombinも同様に認識配列のC末で切るようです。

(無題) 削除/引用 No.3432-2 - 2014/10/05 (日) 01:14:35 - yyy 個人的にはrecombinantタンパクの実験はやってないので、あくまでも一般的な知識の受け売りです。 タグのC末端で切断する酵素があるタグを使えば良いと思いますが、そういうのは個人的にはenterokinaseしか知りません。切断用の精製されたEnterokinaseも売ってると思います。ただ、最近はあまり見かけない気がするので、今でも売ってるのか分かりませんが。それとも、もう試したでしょうか？ ちなみに、配列-DDDDK-のC末でcleaveします。FLAGタグの配列と重なってるので、酵素による除去の効率さえ良ければ利用価値が高いとは思うのですが。

N末付加配列のないリコンビナントタンパク質 削除/引用 No.3432-1 - 2014/10/04 (土) 22:48:44 - Pier リコンビナントタンパク質の作製を試みています。 N末端に余計な配列を付加したくありません。 N末端がグルタミンのタンパク質で開始メチオニンが通常除去されません。 pET22b ベクターを使用すれば、N末端に余計な配列がないまま発現させられるかと思い、 （pelB配列付加タンパク質を発現するが、pelB配列は大腸菌内で除去されると考えられるため） 試しましたが、発現量が少なすぎるので、違う方法を検討しています。 融合タンパク質(Hisタグ等）がついたものを発現させ、酵素で除去する方法等でも構わないのですが、 Factor Xa などは酵素処理の効率が悪いなどの噂を聞き、どのような発現系がよいか悩んでいます。 発現は可溶性画分でも不溶性画分でもどちらでも構いません。 目的タンパク質のN末端に余計なアミノ酸の付加がないリコンビナント作製で、良い方法がありましたら教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします。

全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---