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免疫染色のバックグラウンド トピック削除
No.3431-TOPIC - 2014/10/04 (土) 19:25:40 - DABDAB
いつも勉強させていただいております。
免疫染色のバックグランドが高く困っております。

マウスの肝臓・腎臓を対象にいくつかのタンパクの免疫染色をしています。
蛍光染色ではうまく染まらず、感度良く染めたいということから、polymer法（ImmPRESS)、ImmPACT DABを用いて発色させて実験しているのですが、バックグラウンドが非常に高く困っています。
ImmPRESS、ImmPACT DABの濃度は説明書通りの濃度で実験しており、ImmPACT DABの説明書では、2-10分発色反応させる様になっていますが、1分もすると、バックがかなり茶色になってきてしまうため評価が困難となってしまいます。

内因性ペルオキシダーゼの阻害は3％H2O2 5分で行っており、1次抗体なしのサンプルではバックがほとんど染まらないため、内因性ペルオキシダーゼの阻害は問題ないと思っています。
各抗体反応間の洗浄はPBS5分×3で行っており、detargentは用いていません（面倒だから、という理由も大きいですが、蛍光でも検出できるタンパクを染めた時には、この洗浄で十分染色できていたため、とりあえずはdetargentなしで洗浄しています）。
自分なりにいくつか改善点を考察し、

@1次抗体の濃度を下げる
AImmPACT DABの組成・反応時間は、polymer法に対しては強すぎる、と判断して、ImmPACT DABの組成を薄める
Bdetargentを用いてできるだけ洗浄する

などを考えたのですが、皆様のご経験・ご意見もお伺いしたく書かせていただきました。

1次抗体の濃度は、既報や他のラボの人から教えてもらった濃度ですが、どの抗体でも共通してバックグラウンドが高いのですが、それでも1次抗体の濃度から調整すべきでしょうか？
一般的に、polymer法でのDAB発色の濃度・時間は、増感のない場合と変えて調整が必要でしょうか？
detargentを用いて洗浄するかどうかで、それほどまでにバックグラウンドのシグナルが変わるものでしょうか？
DAB発色は、肝臓・腎臓では難しいのでしょうか？

ご教授のほど、よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3431-5 - 2014/10/06 (月) 22:36:53 - 名無し
たぶん１次抗体が残念な抗体なんだと思うので、買い替えるか、ロット交換するのが一番確実とおもう。交換ならば代理店通して事情を伝えれば、最近は（簡単な書類をデータ添付で提出する必要があるかもしれないけど）無償で対応してくれることは多い。あと、たまにだけど、１次抗体がブロッキング剤の中の何かと変な感じに反応してしまいBGがやたら上がることもあるので、ブロッキング剤の種類を変えて（ブロッキングなし、も含めて）検討してみれば。

(無題) 削除/引用
No.3431-4 - 2014/10/05 (日) 07:44:12 - DABDAB
APさん、おおさん

ありがとうございます。
抗体の変更はお金の問題もあるので、まずは一次抗体の濃度を中心に条件検討してみたいと思います。
増感の系に関わらず、一般的なDABの発色時間（2-10分）で適切に染まるような一次抗体の濃度を探し出すべきですよね？


また前吸収はやったことがないのですが、過去ログも参考にトライしてみたいと思います。

染色に使用した一次抗体を回収して再利用する、というのも前吸収と同じような効果があると思うのですが、一次抗体の再利用は皆様どれぐらい行われているものでしょうか。
抗体を希釈した状態での保存性・再利用の回数について、どれぐらいまでなら問題なく使える、というご経験があればこれについてもご教授お願いします。

(無題) 削除/引用
No.3431-3 - 2014/10/05 (日) 04:14:21 - おお
>1次抗体なしのサンプルではバックがほとんど染まらないため、

とここを指摘しようと思いましたが、すでにしてきがあります。

わたしもきっとまずは1次抗体の条件をいじります。

まあバックのでかたは、検出系の感度にも影響されますから、もう少し弱いclassicな検出系にするのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用
No.3431-2 - 2014/10/04 (土) 22:27:18 - AP
>1次抗体なしのサンプルではバックがほとんど染まらないため、
というのだから、一次抗体の問題なんでしょうね。
もっといい抗体を使うというのが一番の解決法のように思います。
それが不可能なら、濃度を下げるのはまずやってみるべきポイントです。
ポリクロであれば、前吸収も有効です。

免疫染色のバックグラウンド 削除/引用
No.3431-1 - 2014/10/04 (土) 19:25:40 - DABDAB
いつも勉強させていただいております。
免疫染色のバックグランドが高く困っております。

マウスの肝臓・腎臓を対象にいくつかのタンパクの免疫染色をしています。
蛍光染色ではうまく染まらず、感度良く染めたいということから、polymer法（ImmPRESS)、ImmPACT DABを用いて発色させて実験しているのですが、バックグラウンドが非常に高く困っています。
ImmPRESS、ImmPACT DABの濃度は説明書通りの濃度で実験しており、ImmPACT DABの説明書では、2-10分発色反応させる様になっていますが、1分もすると、バックがかなり茶色になってきてしまうため評価が困難となってしまいます。

内因性ペルオキシダーゼの阻害は3％H2O2 5分で行っており、1次抗体なしのサンプルではバックがほとんど染まらないため、内因性ペルオキシダーゼの阻害は問題ないと思っています。
各抗体反応間の洗浄はPBS5分×3で行っており、detargentは用いていません（面倒だから、という理由も大きいですが、蛍光でも検出できるタンパクを染めた時には、この洗浄で十分染色できていたため、とりあえずはdetargentなしで洗浄しています）。
自分なりにいくつか改善点を考察し、

@1次抗体の濃度を下げる
AImmPACT DABの組成・反応時間は、polymer法に対しては強すぎる、と判断して、ImmPACT DABの組成を薄める
Bdetargentを用いてできるだけ洗浄する

などを考えたのですが、皆様のご経験・ご意見もお伺いしたく書かせていただきました。

1次抗体の濃度は、既報や他のラボの人から教えてもらった濃度ですが、どの抗体でも共通してバックグラウンドが高いのですが、それでも1次抗体の濃度から調整すべきでしょうか？
一般的に、polymer法でのDAB発色の濃度・時間は、増感のない場合と変えて調整が必要でしょうか？
detargentを用いて洗浄するかどうかで、それほどまでにバックグラウンドのシグナルが変わるものでしょうか？
DAB発色は、肝臓・腎臓では難しいのでしょうか？

ご教授のほど、よろしくお願いいたします。
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