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(無題) 削除/引用 No.3418-13 - 2014/10/07 (火) 05:11:01 - 中西部ポスドク J Cell Biol. 2007 Dec 17;179(6):1193-204. A molecular specificity code for the three mammalian KDEL receptors. やはりKDELはC末であると理解しています。 先日ポストしたpShooterプラスミドでもN末にシグナルペプチドを、C末にタグの後にKDELをつけています。 リソソームへ送るための配列は途中でも動いたような気がします。

(無題) 削除/引用 No.3418-12 - 2014/10/02 (木) 13:42:56 - おお >[Re:7] myaさんは書きました : > ということは必ずしもKDEL配列がC末端にある必要はないということですね。思い違いをしていました。 大昔に、C-末ばかりを見てたけど、よく見たらこんなところにあったみたいな話をきいたことがあるのですが、、、今調べる限りはC-末ばかりですね。。。ほかの方の指摘でtagの後につけるという指摘もありますし、私より経験や知識で詳しい方のような気がします。混乱させてすいません。

(無題) 削除/引用 No.3418-11 - 2014/10/02 (木) 08:17:27 - む 例え話のようなのですが、KDEL配列にタグをつける場合はざっと見た感じではtag-KDELが多いように感じました。先攻研究でKDEL-tagのタンパク質を作って問題なく機能しているのであれば大丈夫だと思いますが。 100baseで相補鎖が20base程度のプライマーを使って、cDNAからPCRするのは効率や非特異的な増幅の可能性が高くなることから、個人的にはやろうと思いません。 代替として、 1. nested PCRで目的の範囲より大きめの産物を増えやすいプライマーで増やしてから、PCR産物を35baseと100baseのプライマーで再度増幅する。 2. target (w/o stop)-RE site Aのプライマーで増幅したものをプラスミドに組み込み、RE site A-3xMyc-Hisx6(-必要であればKDEL)-RE site Bの相補的なオリゴをアニーリングしたものをライゲーションで導入する。 2の方法だと制限酵素Aを使えば他のタンパク質も導入できるベクターを作れます。 もちろん、先にオリゴをベクターに入れてもよいです。

(無題) 削除/引用 No.3418-10 - 2014/10/02 (木) 07:35:35 - 774R 追記 100merとか150merとかになる場合は、70-80merのプライマーを2本注文して2段階のPCRで伸ばしたほうが、結果的に確実で安上がりかもしれません。 （1回めのPCR産物を鋳型に2回めのPCRをやるという意味です。）

(無題) 削除/引用 No.3418-9 - 2014/10/02 (木) 07:27:52 - 774R >タグ付きプライマーでPCRを行う場合には、プライマー長が長くなる分、難しいと書かれてありました。 100mer超のプライマーは滅多に使いませんが、80mer程度のものなら普通に使ってます。精製も脱塩グレードです。 確かに合成エラーは起こりますが、8クローンくらい拾ってシーケンスすれば、必ず当たりが存在する印象です。 （ちなみに、プライマーはInvitrogen、酵素はPhusionを使っています。） 既にクローン化された鋳型（プラスミド等）を使う分には、PCRの難易度の問題はほとんど起きないですね。 なので、労力が増えるというよりは、単純にプライマーの代金が増えるだけという印象です。それも数千円程度ですし。

(無題) 削除/引用 No.3418-8 - 2014/10/02 (木) 07:19:09 - mya 連投すみません。 以下のようなサイトをみました。 今回私もリバースプライマーの長さが100塩基もありますので、難しいことが想像されました。 http://okwave.jp/qa/q2390806.html また、プライマーも通常のオーダーではなく、より一層エラーの少ない調製法/確認法レベルでオーダーしなければならないなど、知らないことが書かれてありました。 今回templateとして組織より抽出したcDNAを用います。 また過去のトピックにもタグ付きプライマーでPCRを行う場合には、プライマー長が長くなる分、難しいと書かれてありました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;Code=4478 となるとtagが既に入ったものの方が、と考えてしまいます。 皆様の感覚をもう一度教えてください。お手数おかけします。

(無題) 削除/引用 No.3418-7 - 2014/10/02 (木) 06:27:03 - mya みなさまご回答いただき誠にありがとうございました。 おおさま >一概にいえないのですが、ERを介して合成される蛋白はC末にtagを入れる場合が多いです。 ということは必ずしもKDEL配列がC末端にある必要はないということですね。思い違いをしていました。 774R様、~様 はい。地方におりまして、周辺環境や経済状況によりコマーシャルなものは買えない、すぐ近場の人に貰いに行く事ができないなどありまして質問させていただきました。前の研究室にお願いするのも手かなと思うのですが、その場合と、プライマーにtagを入れた場合とでは労力的に違いがあるのかなと思いました。 中西部ポスドク様 大変興味深い資料を添付していただきありがとうございます。重要そうですので、しっかり読んでみます。 独り言様 やはりその方法が安全策ですよね。 その論文によると、全長のC末に3xMycとHisx6を付けていました。 リバースプライマーのデザインについて再度質問させてください。 目的の遺伝子のストップコドンを抜いた末端20塩基に、3xMycとHisx6に対応する塩基、それから制限酵素認識配列を付けると103塩基になりました。（フォワードプライマーは制限酵素認識配列、Kozak配列、ATGから始まる20塩基をあわせて35塩基でした。） 私の疑問は、tagがこのようにとても長い時に、目的の遺伝子にハイブリダイズできる塩基長がわずか20塩基となりますが、この場合PCRが上手く行かないなどのリスクはありますでしょうか？ これまでtagをプライマーに付けた経験がなく、フォワードプライマーもリバースプライマーもせいぜい30塩基のものしか使用したことがなく、その塩基長のほとんどは目的遺伝子とハイブリダイズできます。 今回、20塩基よりも長くとった方がいいとか、フォワードプライマーもリバースに合わせて同じ100塩基長のデザインにすべきなど注意点ありますでしょうか？ 大変初歩的な質問で恐縮ですが、どうか教えてください。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3418-6 - 2014/10/01 (水) 22:28:31 - 独り言 過去に報告されている似たようなタンパク質がどのようにタグを付けているかを参考にするのがよい。

(無題) 削除/引用 No.3418-5 - 2014/10/01 (水) 22:19:27 - 中西部ポスドク Lifetechnologies pShooter-myc-ER などを参考にしてみて下さい。

(無題) 削除/引用 No.3418-4 - 2014/10/01 (水) 21:11:14 - ~ 欲しいベクターを探してみるための時間をかけられないほどお忙しいのでしょうか？ >既にtagが組み込まれたベクターをどうにか見つけて と言われていますが、探しているのは >研究室にFLAGやHAタグが組み込まれたベクターがありませんでした。 と書かれていますので、FLAGやHAタグが組み込まれた発現ベクターなのですよね？ 他の条件がないのでしたら、カタログ製品にあります。 FLAG http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006926 HA http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006190 ・ベクターを発注し、制限酵素で切り貼り ・オリゴDNAを発注し、PCR だけを行うのであれば、ほとんど労力は変わらないと思います。 ただ、ベクターを買うのであれば増やしてラボ用のストックを作ることが求められると思いますので、使い捨てできるオリゴDNAの方がラボ共有の仕事に振り回されずに済むかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3418-3 - 2014/10/01 (水) 16:55:31 - 774R �@についてですが、 目的の位置にタグが組み込まれたベクターをどうにか探す労力 　　　　　vs プライマーにタグを追加する労力 の違いですよね？ これはベクターがどれくらい簡単に見つかるかに依存しているので、なんとも言えませんね・・・

(無題) 削除/引用 No.3418-2 - 2014/10/01 (水) 16:39:35 - おお 一概にいえないのですが、ERを介して合成される蛋白はC末にtagを入れる場合が多いです。それで試してみて、局在が内在性のもとの一致していればそれでよし、なければそれぞれで独自の工夫をしているのではないかと。 ベクターなんかでシグナルペプチド-tagになっていてシグナルペプチド切断部位の直後にタグをおいて、そこの目的の蛋白のシグナルペプチドをとったものが入れれるようなものも売ってたりしてたと。。。 まあプライまーなどでtagの配列を入れてもできます。その辺は臨機応変にやればいいんじゃないでしょうか。

タグタンパク質の作り方について 削除/引用 No.3418-1 - 2014/10/01 (水) 14:52:38 - mya タグタンパク質の作り方について２つ質問がありまして、ここで質問させてください。 �@数十残基ほどのアミノ酸から成るタグ（FLAGやHA）が付いた融合タンパク質をHEK293T細胞に発現させたいです。しかし、研究室にFLAGやHAタグが組み込まれたベクターがありませんでした。この時、プライマーにtagの配列を入れてPCRすればいいと想像しますが、一方で、既にtagが組み込まれたベクターをどうにか見つけて、それに目的の遺伝子のみを挿入するのとではどちらが労力的に大変でしょうか？ �A興味ある遺伝子のどこかに細胞内局在を規定するアミノ酸配列がある場合、例えばそれをC末のKDEL配列で例えるとすると、そのようなタンパク質のC末にtagを付けねばならない際には、 【［ATG］から［C末のKDELを除いた最後のコドン］】-【tag】-【新たなKDEL】-【ストップコドン】とした方がいいと想像しますが、 【［ATG］から［STOPコドンの一つ手前のコドン］】-【tag】-【ストップコドン】とするとやはり小胞体には留まれないのでしょうか？あるいはtagはプラプラしているのでKDEL配列は上手くワークするでしょうか？みなさんならどうプラスミドを構築しますか？ 局在規定シグナルや局在がそもそも明らかとなっていないタンパク質の場合、どのようにプラスミドを構築すればいいのかにも困惑しています。 大変初歩的な質問で恐縮ですが経験がないためにどうかよろしくお願い致します。

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