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(無題) 削除/引用 No.3407-7 - 2014/09/27 (土) 08:38:41 - いん まわしものではないですが、参考までに。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/upload/upld87/protocol-c/kodplus87pc01.pdf キットを買わなくても、下記の酵素をそろえればできます。 High-fidelity polymerase（TaqなどTdT活性があるものは不可） DpnI Polynucleotide Kinase Ligase ちなみに、StratageneのQuikChangeは相補的なプライマーで増幅するので、ニックが入った環状プラスミドができます。 そのまま大腸菌に入れると大腸菌の中で修復されるので、リン酸化やligationは必要ないという原理です。 こちらは、polymeraseとDpnIがあればキットを買わなくても自前でできます。

(無題) 削除/引用 No.3407-6 - 2014/09/27 (土) 01:35:41 - 77 774Rさん 詳しい説明をありがとうございます。 REサイトに作り替えるというのはポジティブクローンを拾う際にはいい方法ですね。 私の場合にもそれが可能か検討してみます。 随分前にstratageneのquick mutagenesis kitを使ってpoint mutationを作製（上司に言われたまま手を動かしていたというのが本当のところですが）しました。 その際には外向きのプライマーペアを作ってぐるっと一周してプラスミドを合成した後、Dpn1で切ってtransformしました。 なぜ当時、ligation操作が必要なかったのか、リン酸化操作をしなかったのかが不明です…一度調べてみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3407-5 - 2014/09/27 (土) 01:14:11 - 77 いんさん、Harmoniaさんありがとうございます。 やはりそのようにプライマーを設計するんですね。 A-B-C-D-Eのタンパク質配列のうち、C-Dを抜いた欠失体を作るためにA-BのDNA配列の外向き（相補鎖）のプライマーと、Eの外向き（順向き）のプライマーを設計すればいいんですね。 環状のプラスミドをtemplateとした場合に、これらプライマーがどのように増幅するのか頭がこんがらがりました。プライマーを足場に外向きにDNA合成していって、めぐりめぐってやがて元のプライマーのお尻に追いついたらどうなるんだろう・・と… 基本的にはPfuのようなblant endになるようなDNAポリメラーゼでPCRを行って、その後、blant end用のligation protocolにならえばいいといいことであっていますでしょうか？すみませんがまた確認させてください。

Inverse PCRのコツ 削除/引用 No.3407-4 - 2014/09/26 (金) 20:57:39 - 774R Inverse PCRのプライマーを設計する時に、もし、サイレントな変異でユニークREサイトを導入できると、セルフライゲーションが楽で確実になります。 PCR後にRE処理（DpnIと同時に）して、セルフでOKになります。 通常は、プライマーをリン酸化してPCRか、PCR産物をリン酸化しますが、その手間が省ける上に、経験上、一塩基欠損などがある程度の割合で出てきます。 RE処理後セルフの方法だと、ミニプレップ後にREで切れたものはほぼ間違いなく当たりということになります。 ＊RE：制限酵素

(無題) 削除/引用 No.3407-3 - 2014/09/26 (金) 20:32:07 - Harmonia 欠失もアミノ酸置換も「2. Inverse PCR法」でやりました。 移し替えました。

(無題) 削除/引用 No.3407-2 - 2014/09/26 (金) 17:00:11 - いん すでにクローニングができているなら、inverse PCRが簡単だと思います。 BのC末からN側に向かうプライマーとEのN末からC側に向かうプライマーを設計して、プラスミド丸ごと増やしたあとに、環状化して大腸菌にトランスフォーメーションします。 プラスミドのサイズが大きい場合は、増幅効率に依存するのでお勧めできませんが。 high-fidelityの酵素ならだいたい問題ないですが、cDNAのシークエンスは確認します。ベクター自体に問題ないかをベクター全部のシークエンスを確認してもいいですが、発現ベクターに組換え直すと簡単です。 BとEのつなぎ目にリンカーが必要であれば、プライマーに付加したり、BとCあるいはDとEの間のフレキシブルな部分を残して増やすとよいと思います。

deletion mutantの作製方法について 削除/引用 No.3407-1 - 2014/09/26 (金) 16:05:23 - 77 いつも勉強させていただいており、大変感謝しています。 私は今約1000アミノ酸より成るタンパク質をコードするcDNAをベクターにクローニングしました。 上司から、そのうち真ん中に位置する約400アミノ酸を欠失する変異体を作製してはどうかと提案されました。私としてもそのような変異体をぜひ作製したいと思っています。 調べるといくつかの方法があるみたいです。 例えば私のタンパク質の構造が、A-B-C-D-Eとして、C-Dを抜いた欠失体だとA-B-Eとなる場合を例に、 1. overhang PCR法。 プライマーのデザインに工夫をして、 A-Bの断片、Eの断片をそれぞれPCRで増幅。 その後、プライマーなしPCRおよび両端のプライマーを用いたPCRでjA-Bの断片とEの断片ointさせる方法。 2. Inverse PCR法。 欠失させたい断片の外向きのプライマーを設計。・・・このinverse PCRは理解できませんでした。 どちらの方法で欠失体を作製するのが一般的なのでしょうか？

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