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(無題) 削除/引用 No.3404-5 - 2014/09/27 (土) 05:25:10 - 中西部ポスドク おかさん ありがとうございます。仰る通りです。 CRISPR guide RNAで20塩基程度のバリエーションなので、蛋白の過剰発現程は増殖に影響しないとは期待しているのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.3404-4 - 2014/09/27 (土) 04:41:47 - おか 増幅を繰り返すと大腸菌で増えやすいクローンと増えにくいクローンが偏るので、トランスフォーメーションの効率を上げて偏らないようにするためです。当たりのクローンが大腸菌で増えにくいという不運がなければケミカルコンピ店とセルでも行けると思います

(無題) 削除/引用 No.3404-3 - 2014/09/27 (土) 02:59:46 - 中西部ポスドク おおさん　ありがとうございます。 libraryのサイズはおよそ60000クローンです。 competencyに関してはAgilentでSure2 supercompetent cellという1x10^9のものを見つけて、実際に期待される程度のコロニー数は取れて、libraryをexpandしてみたのですが、実際にこれを使って実験を進めて良いものか考えている所です。コロニー数は計算上4million強で推奨が3million以上（５０個／クローン）でした。 入りにくい以外は同じと考えて大丈夫なのでしょうか？ 基本的には大腸菌株は同じで、遺伝子導入法のみが異なると理解していたのですが、プロトコールに強く書いてありましたので、少し心配になったのです。

(無題) 削除/引用 No.3404-2 - 2014/09/26 (金) 06:47:15 - おお たぶんcompetencyが一番の要因かと思いますが。あとそれに関係あると思いますけど、ベクターのサイズですね。大きいとケミカルの方はelectropolation にくらべて顕著に落ちてくるんじゃなかったかなと。。。ぐたいてきにどの程度の大きさでどれくらいというのは言いにくいですけど。 そのlibraryのindependent clone数はどれぐらいでしょうか。

chemical competent cellとelectroporationの違い 削除/引用 No.3404-1 - 2014/09/26 (金) 05:21:30 - 中西部ポスドク いつもお世話になっております。 MITより入手したlentiviral CRISPR libraryを増幅しようと思うのですが、推奨プロトコールではchemical competent cellではなくelectroporation competent cellを使うようになっていました。 これは単にcompetency（一般的に後者が高く、10^8と10^9ぐらいの差 ）の違いによるものなのでしょうか？ それともchemical competent cellとelectroporation competent cellに何かしらの違いがあるのでしょうか？後者を今まで使ったことがなく、ラボにも機械がないため、前者しか選択肢がないのですが、どのような問題があるのかご存知の方がいらっしゃいましたら御指導頂けますと幸いです。

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