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(無題) 削除/引用 No.3393-22 - 2014/10/17 (金) 16:36:27 - mbb 初代培養からやりなおして、新しい Isotype control（非標識）を用いて 免疫染色をやりなおしてみました。 本件で行った免疫染色と同じ条件で 1次抗体を反応させ、二次抗体でFITCの 蛍光を確認したところ、Isotypeでは 蛍光像が殆どみられず、通常の抗体で は綺麗に蛍光が観察されました。 おそらく、こめさんがご指摘くださった とおり、前回蛍光が検出されたのは、 1次抗体にコンジュゲートされた蛍光 色素がタンパク吸着に影響をしていた のではないかと考えています。 皆様の多くのご意見により実験が成功 いたしました。大変ありがとうござい ました。

(無題) 削除/引用 No.3393-21 - 2014/09/28 (日) 20:55:41 - L 一次抗体の、標的抗原以外のタンパク質との結合（完全に非特異な結合ではなく、他のタンパク質との交差反応）を、アイソタイプ抗体で否定するのは無理かもしれません。その一次抗体のウエスタンでは、標的タンパクのみのシングルバンドで検出できるのでしょうか？ 標的タンパクのノックアウトあるいはノックダウンの細胞をネガコンとして用いて、目的の細胞と同様に染色をしてみるのが、一番良いと思いますが、マウス以外の動物からの初代培養との事なので、無理ですかね？ 免疫染色でのメタノール固定は、個人的にはほとんどやらない（形態に影響するので）ですが、FACSで細胞周期を見る時には使ってます。必要に応じ、表面マーカーをFITCやAlexa488標識の抗体で染めてからメタノール固定したりしますが、私が実際に調べた表面抗原（造血系で５種類くらい試しました）はメタノール固定後も細胞に残っていました。お使いのアイソタイプがFACS染色の条件では大丈夫なのであれば、この条件で２次抗体までやってから、サイトスピンかスメアーでスライドにのせてメタノール固定してみるのはどうでしょうか？　ただしこの場合、蛍光顕微鏡とFACSの結果は同じになると思われ、アイソタイプコントロールとの差を検出するのは難しいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3393-20 - 2014/09/28 (日) 13:33:18 - mbb Rさん コメント有難うございます。 > 抗体って精製条件なんかでタイター変わりますよね。 > > そんなんで、コントロールって言えるのかなって思ってます。 ネガコンなので、タイターよりもモル濃度が重要かと 思ってました。isotypeはどれにも反応しないなら タイターが測れないのでしょうし・・・測れるので しょうか？ 以前読んだ記事で、結構な割合の抗体が特異性に 問題があるようなことが書いてありました。 http://www.labome.com/method/Antibody-Quality.html http://www.biotechniques.com/news/Antibody-Validation-Whose-Job-is-it/biotechniques-347556.html#.VCePakc0LbQ 分析する上で特異性が一番重要なのはわかって いて、こういうのを読むと不安になります。。。

(無題) 削除/引用 No.3393-19 - 2014/09/26 (金) 22:57:03 - R 私は免疫に疎いのでよく疑問に思うのですが、 抗体って精製条件なんかでタイター変わりますよね。 そんなんで、コントロールって言えるのかなって思ってます。 ていうか、目的の抗体でもウェスタンなんかだとノンスペが出るのが当たり前みたいな雰囲気だし、、、 いや、特異性はあるんですよ抗体によりけりで、 ってことで、同じanti-xxxでもどこの抗体か変わってくるんですよね。 もう、nega contは抗体なしの方がいいじゃんって思うんだけど、レフリー次第ですものね。 (理屈ではisotype controlってわかるんですけど、 そんなことを気にするほど抗体って特異性があるのって思います、 抗体によりけりですけど)

(無題) 削除/引用 No.3393-18 - 2014/09/26 (金) 17:18:43 - mbb こめさん ご助言有難うございます。 > あと、IgG1などサブクラスのコントロールはミエローマやハイブリドーマで作製したモノクローンがほとんど（全て？）で、ヒトやマウスなどの細胞に反応しないことを確認しているので、いろいろな抗原に反応するというこはないはずです。 現在利用している細胞がヒトやマウスではない ので、反応しているのかも・・・でも哺乳類では あるので、やはり反応していると考えるほうが 不自然なのでしょうか？ > 基本的に、isotype controlを用いるときは、ターゲットに対する抗体と同じ種類を同じ量使います。 > なので、未標識の抗体を使用して、標識した二次抗体を使用するほうが、コントロールとして適していると考えられます。 はい、そこは承知しているのですが、たまたま 同じサブクラスの抗体を入手できたので、試し てみたのです。 濃度としては、isotypeも目的タンパクの抗体も 約10mg/mLの原液を1/100希釈で使用しました。 説明書に書いてあるプロトコルにはパラフィン サンプルの免疫染色のことしか書いてなく、 使う量もちょっと多いようだったので、段階希釈 してシグナルが十分得られる濃度を決めました。 > 標識二次抗体と比較して多量であれば、それだけ非特異的なシグナルが出てしまうと思います。 確かに1次抗体の非特異性がないことをみたかっ たので、1次抗体の濃度にあわせていました。 > また、標識抗体の場合、蛍光色素による非特異的な相互作用もあることを経験しています。 > これは色素の種類で異なるようで、ある蛍光色素を用いたときのみ非特異的なシグナルが出た事があります。 Alexa488が標識してありました。色素による 吸着という影響もあるのですね。免疫染色に 利用されている分子なので安心しすぎてました。

(無題) 削除/引用 No.3393-17 - 2014/09/26 (金) 16:40:17 - mbb おおさん いつもありがとうございます。 > はい。理論的にはそうですが、スペシフィックなシグナルは意外と残ることがあります。まあやってみないとわからないところもありますけど。 そういうこともあるのですね。Helaであれば いつも継代時に細胞が余っているので、それの ライセートを調製してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3393-16 - 2014/09/25 (木) 17:52:25 - こめ あと、IgG1などサブクラスのコントロールはミエローマやハイブリドーマで作製したモノクローンがほとんど（全て？）で、ヒトやマウスなどの細胞に反応しないことを確認しているので、いろいろな抗原に反応するというこはないはずです。 また、メタノールやPFAなど固定の方法で抗体の認識性が変わるかもしれませんが、抗体によるとしか言えないので、どちらでも大丈夫な抗体もあれば、固定法を選ぶ必要がある抗体もあります。 普通は、データシートに書いてます。

(無題) 削除/引用 No.3393-15 - 2014/09/25 (木) 17:42:07 - こめ 基本的に、isotype controlを用いるときは、ターゲットに対する抗体と同じ種類を同じ量使います。 なので、未標識の抗体を使用して、標識した二次抗体を使用するほうが、コントロールとして適していると考えられます。 今回、標識したisotype controlを用いていますが、実際どのくらい使用したのでしょうか。 標識二次抗体と比較して多量であれば、それだけ非特異的なシグナルが出てしまうと思います。 また、標識抗体の場合、蛍光色素による非特異的な相互作用もあることを経験しています。 これは色素の種類で異なるようで、ある蛍光色素を用いたときのみ非特異的なシグナルが出た事があります。 いずれにしても、新しくisotype controlを購入してもよいということなら、未標識のものを購入することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.3393-14 - 2014/09/25 (木) 13:09:32 - おお >[Re:13] mbbさんは書きました : > おおさん > いつもご助言ありがとうございます。 > > 細胞のlysateなどをblockingに混ぜるだけでもノンすぺはそっちに吸収されたりするので、、、 > > 残念ながら手持ちの細胞は全て目的タンパクを > 発現するらしいので、ノンスペを吸収するために > 細胞のライセートを使うことはできないのです。 はい。理論的にはそうですが、スペシフィックなシグナルは意外と残ることがあります。まあやってみないとわからないところもありますけど。

(無題) 削除/引用 No.3393-13 - 2014/09/25 (木) 11:48:39 - mbb おおさん いつもご助言ありがとうございます。 > 細胞のlysateなどをblockingに混ぜるだけでもノンすぺはそっちに吸収されたりするので、、、 残念ながら手持ちの細胞は全て目的タンパクを 発現するらしいので、ノンスペを吸収するために 細胞のライセートを使うことはできないのです。 まさかネガコンにのみライセートを入れるわけ にもいきませんので・・・ 名無しさん ご回答有難うございます。 > control IgGとはいっても抗体は抗体なので、なにかしら抗原はあるとおもうので、たまたまそういうもの、あるいはそれと似たものがその細胞にあれば反応するのは不思議ではないとおもう。たぶん、特に特定の抗原に反応する抗体を高度に精製しているものではないので、いろんな抗原特異性を持つIgG1の混合物とおもうし。 Isotype controlってそういうものなのですね。 全く勉強不足でした。 予算的に厳しいのですが、ボスと交渉して新しく Isotypeを購入できることになりました。 もしよろしければ、おすすめのIsotypeもしくは 抗ケミカル抗体のメーカーを教えていただけると 大変助かります。 引き続き何でも良いのでご助言いただきたく思って おりますので、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3393-12 - 2014/09/25 (木) 07:04:15 - おお WBでノンすぺを確認しながら条件をさぐる。ノンすぺを吸収できそうなものをblockingに混ぜるというのはやってもいいかもしれません。 細胞のlysateなどをblockingに混ぜるだけでもノンすぺはそっちに吸収されたりするので、、、

(無題) 削除/引用 No.3393-11 - 2014/09/24 (水) 22:16:21 - 名無し control IgGとはいっても抗体は抗体なので、なにかしら抗原はあるとおもうので、たまたまそういうもの、あるいはそれと似たものがその細胞にあれば反応するのは不思議ではないとおもう。たぶん、特に特定の抗原に反応する抗体を高度に精製しているものではないので、いろんな抗原特異性を持つIgG1の混合物とおもうし。 ウサギとかだと、細菌と相同性の高い比較的配列の保存された蛋白質に対する抗体とかはもってることはよくあるらしい。マウスも飼育状況によってはマウスだとそういう抗体は出来てることはある。 一つはメーカーやロットを変えて見るとか、あるいは薬物や化学物質に対するIgG1抗体で代用するとか方法はあるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.3393-10 - 2014/09/24 (水) 17:51:59 - mbb おおさん ご返答有難うございます > methanolだと厳しいかもしれませんね。抗体も変性するので、相互作用がなくなって流れちゃうかもしれませんし、、、経験上うまくいったとかいうコメントがあれば、、、 > > PFA作れないとこことですが、ホルマリンやready to useのformaldehydeなどは使えないのかな。。。 > それでも通常の操作中でも揮発してガスがでるので、、、 やはりMeOHは厳しいですか。そうすると架橋剤に頼る として、EDCくらいしかうちの環境では利用できない かもしれません。EDCが固定に使えるという話は聞いた ことがないのですが。 費用が許すかどうかわかりませんが、染色プロトコルの 見直しをすべきかもしれないですね・・・

(無題) 削除/引用 No.3393-9 - 2014/09/24 (水) 11:52:28 - おお methanolだと厳しいかもしれませんね。抗体も変性するので、相互作用がなくなって流れちゃうかもしれませんし、、、経験上うまくいったとかいうコメントがあれば、、、 PFA作れないとこことですが、ホルマリンやready to useのformaldehydeなどは使えないのかな。。。 それでも通常の操作中でも揮発してガスがでるので、、、

(無題) 削除/引用 No.3393-8 - 2014/09/22 (月) 09:27:28 - mbb おおさん 度々のご回答感謝いたします。 > 細胞表面の抗原を見たいのであれば、生細胞をまずラベルして、もちろんあらってから、固定して2次抗体という手が取れますけど。 今回の結果は細胞内の細胞骨格タンパクを標的にした ものですが、FACSでは表面抗原を標的にしていました。 ラベル後の固定とのことですが、具体的にはどのような 固定方法が利用できるのでしょうか？ 現在は主にMeOHを用いた固定を行っております。この方法 だと表面の脂質と一緒に抗原も流れてしまうと思っていま したが、利用可能でしょうか？ 現在の環境上PFAを調製することが難しい（換気装置や窓 がない）ので、可能であればMeOHで済ませたいのです。

(無題) 削除/引用 No.3393-7 - 2014/09/22 (月) 05:30:14 - おお 細胞表面の抗原を見たいのであれば、生細胞をまずラベルして、もちろんあらってから、固定して2次抗体という手が取れますけど。

(無題) 削除/引用 No.3393-6 - 2014/09/21 (日) 23:21:07 - mbb alphaさん ご回答ありがとうございます。 > 私は免疫染色よりも、FACSをよく実施しますが、FACSでもIsotypeは染まりますよね？ > （染まるというか、ゲート設定に用いるというか…） > 免疫染色でもバックを取り除くために用いているのであれば、バックを消した条件で、サンプルも解析すれば問題ないのでは？ > > 解析目的にもよりますが、FACSする条件が整っているのであれば、初代培養の細胞ならFACSのほうが良いと思いますが？ FACS用に染色したとき、一部を同じ顕微鏡で観察しているのですが、Isotypeで反応させた細胞は蛍光を肉眼で認識できませんでした。染まらないはずのものが光ってしまったので、今回の結果には困っています。 確かにFACSで解析するのが良いと分かっているのですが、現在FACSが使用できない状況であることと、FACSできれいにIsotypeと分離できなかった（目的の抗体の蛍光シグナルが弱かった）場合もあったので、免疫染色を試しているという事情です。

(無題) 削除/引用 No.3393-5 - 2014/09/21 (日) 23:09:52 - mbb おおさん ご回答ありがとうございます。 > そう考えるとシグナルがバックグランドといえないぐらい高いなら、その系では実験が成り立たないということでしょうし、バックグランドの範囲内といえるなら、興味ある抗体で同じようにしかシグナルが出ないなら、その系ではスペシフィックなシグナルが得られていないということですよね。 細胞のないバックから蛍光が観察されていないので、細胞のどこかに吸着したのだろうと思います。つまりシグナルが高い状態です。 一次抗体をつかわないで二次抗体のみで反応させたときは蛍光が観察されませんでした。 一次抗体は論文でよく見かけるモノクロナール抗体のですが、IgG1が非特異的に細胞に吸着するということだと、読んでいる論文の結果も疑っておかなければいけないですね・・・ もしくはIsotype controlが吸着しない反応条件を探索すべきでしょうか。 > > もし細胞表面やしょうほう体などにシグナルが出るならFC receptorに抗体がトラップされているかもしれません。血清などつかうとそれは解決する可能性があります。 > 倍率の高いレンズを持っていないので詳しくはわかりませんでしたが、核も含めて細胞全体に染色されたようでした。ブロッキングにはFBSを使ったのでFCレセプターの可能性は低いと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.3393-4 - 2014/09/21 (日) 18:37:07 - alpha 私が勘違いしていたら申し訳ありません。 私は免疫染色よりも、FACSをよく実施しますが、FACSでもIsotypeは染まりますよね？ （染まるというか、ゲート設定に用いるというか…） 免疫染色でもバックを取り除くために用いているのであれば、バックを消した条件で、サンプルも解析すれば問題ないのでは？ 解析目的にもよりますが、FACSする条件が整っているのであれば、初代培養の細胞ならFACSのほうが良いと思いますが？

(無題) 削除/引用 No.3393-3 - 2014/09/21 (日) 14:46:17 - おお >[Re:1] mbbさんは書きました : > > もしネガコンの結果が正しいとすると、一次抗体に特異 > 性がない、すなわち細胞を同定できていないと解釈すべき > でしょうか？ いろいろ攻めどころはありますが、ネガこんはその実験系バックグランドがでないか、どれぐらいの強さかを見るものですよね。 そう考えるとシグナルがバックグランドといえないぐらい高いなら、その系では実験が成り立たないということでしょうし、バックグランドの範囲内といえるなら、興味ある抗体で同じようにしかシグナルが出ないなら、その系ではスペシフィックなシグナルが得られていないということですよね。 そう考えるとおのずとネガこんの置き方をどうするべきかというのもわかりますよね。 もし細胞表面やしょうほう体などにシグナルが出るならFC receptorに抗体がトラップされているかもしれません。血清などつかうとそれは解決する可能性があります。

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