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(無題) 削除/引用 No.3374-12 - 2014/09/16 (火) 19:35:46 - 得た 中年さんの言うとおり。 ライブラリー作製等でない普通のクローニングならまず不要 むしろ効率高すぎても扱いづらい感触。

(無題) 削除/引用 No.3374-11 - 2014/09/16 (火) 13:59:44 - 中年 液体窒素を用いて急冷するなどの細かい配慮は、10^9/ug以上の形質転換効率を得るためには必要だということなのでしょう（少なくとも原著者の書かれた日本語文献にはそのようにありました）。しかし、ゲルで確認できるようなngオーダー以上のDNAを使ったクローニングの操作で、そのような効率が要求されることはほとんどありません。そこまでやらなくとも問題無いと皆さんが仰っているのはそういう意味だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3374-10 - 2014/09/14 (日) 18:46:29 - papa 私のところも井上法で作製し，氷上から-80度に素早く放り込んでいます。 昔はエタノールで冷やしていましたが。 十数年やっていますが，これで特に問題があったことは特にありません。

(無題) 削除/引用 No.3374-9 - 2014/09/13 (土) 21:17:26 - ドライ 井上法で作ってますけどしばらく液体窒素もドライアイスエタノールも使っていません。 もっぱら氷床で分注して-80℃に放り込んでますが大体8乗近い効率出てます。 確かに使ったほうが安定する気はしますが、そこまで必須なのかな？

(無題) 削除/引用 No.3374-8 - 2014/09/13 (土) 20:59:42 - 独り言 なぜコールドルームで液体窒素を使う必要があるのかわかりませんが、そもそもコールドルームで液体窒素を使うことは非常に危険ですよね。もし質問者さんの以前のラボがそのような使い方をしていたのであれば、危機管理がなっていないラボです。 室温で液体窒素を使用して普通にコンピ作成してました。 また最高の導入効率を求めなければ、簡便な方法では３７度でコンピ増殖させるプトロコールもみたことあります。その場合、回収するタイミングがより厳密になるぐらいで、十分クローニングに使用できるはずです。

(無題) 削除/引用 No.3374-7 - 2014/09/13 (土) 10:22:12 - おお >[Re:6] JM109さんは書きました : > TBで大腸菌を洗った後に再懸濁する際に大腸菌のペレットをどのようにばらしていますか ぼるテックスで一瞬タッチしてというのを繰り返していたとおもいます。これこそコールドルームでやればいいかと。 > コンピテンシーを上げる最も重要なステップとして、OD400あたりで止めることと、18℃くらいで行うことだと思いますが、ラボに室温以下に下がるシェイカーがなく、22-25℃で行いましたが、これではコンピテンシーは低いですよね。。エタノールがコンタミしてしまったので、作製したものを試す気になれないためお聞きしたいです。すみませんがまた教えてください。 > > 温度よりグロースのタイミングだとおもいます。グロースが速いほどベストのタイミングを幅が狭く毎回コンピテンシーがちがうという結果になりやすいんだと思います。 いろいろと改良法も出ていて、室温でもそんなに難しくない方法もあったはずです。 http://openwetware.org/wiki/TOP10_chemically_competent_cells この方法は結構よかったと思います。

(無題) 削除/引用 No.3374-6 - 2014/09/13 (土) 10:08:11 - JM109 774Rさん おおさん 早速のお返事ありがとうございます。 ドライアイスでも大丈夫なんですね。 そして液体窒素で行うのがベストっぽいですね。 エタノールバスにチューブを浸すと、たとえフタにエタノールが付かないよう凍結させても、そのチューブをエタノールバスから上げて袋にまとめていれるとチューブの外の側面に付いてたエタノールが結構袋に持ち込まれそうで、結局チューブ内でいくらか入ってしまいそうですね。アメリカのラボにいるのですが、チューブが完全に閉まらないような粗悪品が結構あって、、 ついでで大変恐縮ですが、もう２点お聞きしてもよいですか？ TBで大腸菌を洗った後に再懸濁する際に大腸菌のペレットをどのようにばらしていますか？ 私は先端をハサミで切ったp1000チップで優しくペレットをTB 5ml中で壊しています。が、中々壊れなくて結局30-50回ほどやることになってしまっています。コールドルーム内で行っています。 コンピテンシーを上げる最も重要なステップとして、OD400あたりで止めることと、18℃くらいで行うことだと思いますが、ラボに室温以下に下がるシェイカーがなく、22-25℃で行いましたが、これではコンピテンシーは低いですよね。。エタノールがコンタミしてしまったので、作製したものを試す気になれないためお聞きしたいです。すみませんがまた教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3374-5 - 2014/09/13 (土) 09:58:25 - おお 慎重にやるなら、ガラスのピペットをつかってあらかじめ冷たいバッファーを通した状態でつかえばコールドルームじゃなくてもいいかと思いますが、そこまでやらなくてもそこそこのものはとれますけど。

(無題) 削除/引用 No.3374-4 - 2014/09/13 (土) 09:54:45 - おお ドライアイスで通常の部屋でやったことがありますけどだいじょうぶでした。ただドライアイスもコールドルームに持ち込むと密閉状態でCO2を発生させている状況なので、だめということになってませんか?液体窒素と同じ理屈だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3374-3 - 2014/09/13 (土) 09:31:02 - 774R コールドルームがダメなら、別の場所で液体窒素で凍らせればいいんですよ。 凍らせる前は on ice で作業してますよね？　その氷の容器ごと通常の実験室に運んで液体窒素で凍らせることは出来ないのでしょうか？ 最後にDMSOを加えてから凍らせるまで10分や20分は置いても大丈夫だから、移動は可能だと思います。 どうしてもエタノール中で凍らせるしかないなら、エタノールの入った容器にラックを置いて、チューブの蓋の部分が浸からないようにラックに挿して凍らせるのがいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3374-2 - 2014/09/13 (土) 09:10:46 - JM109 ドライアイスだけでは凍結が遅く、やはりだめですよね。。

コンピテントセル凍結時のエタノールバスについて 削除/引用 No.3374-1 - 2014/09/13 (土) 09:04:57 - JM109 一点質問させてください。 先日コンピテント大腸菌を作製しましたが、コールドルームでの液体窒素が使用できないためエタノールにドライアイスを入れたエタノールバスを用いて大腸菌を凍結させました。 作製したものを液体窒素タンクではなく、-80℃の冷蔵庫に保存しましたが、数日経ってから使用しようとしたところ-80℃からだしたばかりなのに凍結した大腸菌液の表面に20 ulほどの透明な非凍結液がありました。 おそらく完全に閉めたと思われたキャップがリーキーで、そこからエタノールが入ってしまったのだと予想しています。当然これらはもう使えないとは思いますが、みなさまはエタノールバスで大腸菌を凍結させる際、どのようにされていますか？どのようにチューブを入れていますか？ 私はきちんとフタをして（したつもりというのが正しいですが）、エタノールバスの中に放り込みました。液体窒素が使いたかったのですが、、

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