BioTechnicalフォーラム [過剰発現]

過剰発現

No.3373-TOPIC - 2014/09/12 (金) 22:43:22 - a

いつも勉強させてもらっています。

今，GFPサイトを持つvectorに目的の遺伝子ORFをいれて，細胞で過剰発現をさせたいと思ってます。
GFPはあくまでマーカーの意味合いです。

初歩的な質問ですが，
GFPのN末またはC末にMCSをもつベクターに入れる場合と，
MCSとGFPのプロモーターが別々の場合
MCSとGFPの間にIRESなどがある場合での使い分けはどのようにしているのでしょうか？

単純に過剰発現させたいものの発現を見たい場合がGFPのすぐわきにMCSがあったほうがいいように思うのですが，この場合，いわゆるfusionが作られ，目的遺伝子の発現・機能は変わるのでしょうか？

よろしくお願いします
　

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(無題)

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No.3373-4 - 2014/09/13 (土) 08:14:16 - Harmonia

自己開裂の2AペプチドをIRESの代わりに使うことも増えているようですが、
2Aペプチドを目的タンパク質のN末側にするかC末側にするかで、結果とし
ての活性に影響を与えることがあるようです。

(無題)

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No.3373-3 - 2014/09/12 (金) 23:44:54 - おお

>[Re:1] aさんは書きました :

>
> 初歩的な質問ですが，
> GFPのN末または

GFPとin frameであることと、開始コドンがひつ用

>C末にMCSをもつベクターに入れる場合と，

GFPとin frameであることがひつよう。
終始コドンについては多分内在性のものを使うだろうと思うけど、あるドメインだけ移すならば、つけた方が無難。

> MCSとGFPのプロモーターが別々の場合
> MCSとGFPの間にIRESなどがある場合での使い分けはどのようにしているのでしょうか？

開始こどんと終始こどんに気をつければいいです。

>
> 単純に過剰発現させたいものの発現を見たい場合がGFPのすぐわきにMCSがあったほうがいいように思うのですが，この場合，いわゆるfusionが作られ，目的遺伝子の発現・機能は変わるのでしょうか？

fusion の場合は融合した末端の機能が失われてうまくいかない事はあるようです。場合によってはリンカー(GFPとあなたの蛋白のあいだの余分なアミノ酸)を長くしたりするといいこともあるようですが、それでもだめなこともあります。あなたの蛋白のN末の開始こどんを使うときは、なるべく余計な配列を入れないように一番端っこの酵素で切って入れるようにしている人はいるようですが、絶対的な条件とはいえません。

(無題)

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No.3373-2 - 2014/09/12 (金) 23:11:30 - yyy

fusionタンパクになるかどうか、という点がまず大きいと思います。
GFPとのfusionが局在や機能を変えるかどうかは、発現レベルやタンパクなど複数の要素で決まると思うので、「タンパクによる」としか言えないかと。

IRESに関しては、マーカーと目的タンパクの発現量の違いが問題になる場合に、IRESを使えば少なくとも転写レベルでは同じ、ということが利点になるのだと思いますが、個人的にはIRES入りベクターを使った場合とそうでないベクターを使った場合とで一過性・安定発現とも大きな差を感じたことはありません。まあ、これも「タンパクによる」のでしょうが。

別々のプロモーターと言うのは、安定発現時のsilencingの度合いとか発現量がプロモーター毎に特徴があるので、「発現量をあまり過剰にしたくない」とか「silencingを避けたい」とか実験の目的によって選ぶべきものだと思います。つまるところ、これもやはり「タンパクによる」ですか。

過剰発現

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No.3373-1 - 2014/09/12 (金) 22:43:22 - a

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