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(無題) 削除/引用 No.3363-9 - 2014/09/11 (木) 19:38:47 - 独り言 ゲル濾過前にミリポアのUltrafree-CLのどらかを使用したが、どれを使用したのか８年前を思い出せない。 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Ultrafree-CL-Centrifugal-Filter-Units-with-Microporous-Membrane,MM_NF-C7556

(無題) 削除/引用 No.3363-8 - 2014/09/11 (木) 07:12:43 - TT みなさま、どうもありがとうございます。 ご意見を聞いて、一度フィルターによるデブリスの除去を考えてみようと思います（恐らく、超遠心よりも簡便なイメージがあるためです）。予備検討で、フィルターをかける前後で蛋白量に殆ど差がないことを確認したいと思っています。 なお、この場合のフィルターはどのようなものを使用すればよろしいでしょうか？ 培養用の培地などは0.2umのフィルターを通すことがありますが、蛋白抽出液から不要物を除くという目的で適切なもの（蛋白の吸着が少ない）がございましたら、教えていただければ恐縮です。

(無題) 削除/引用 No.3363-7 - 2014/09/10 (水) 23:37:21 - 名無し カラムかけるものは取り敢えず、遠心して不溶物を十分に除く （andできればさらにフィルターも通す）。使用するバッファーもフィルター通した方がいい（吸引で培地をフィルター滅菌するフィルターとボトルのペアになってるやつが使える）。 これが不十分だと詰まってスムーズに流れなくなり、無理に流すと内圧が高くなる。担体上端部に変なものが沈殿してれば、可能性大。 難溶性の塩の析出とかが起きてそういうのが内部に詰まってるとかの可能性はないかな。リン酸ナトリウム／カリウムとカルシウムの組み合わせとか、はじめは溶けてるけど時間が経つにつれてだんだん析出してくることあるし。 充填時に内部に大きな気泡が入ったとか、充填したカラムを４Cの部屋から室温に出すなどして、気泡が生じたとかでもトラブル起こることある。大きめのカラムの場合、担体のスラリーは何度も分けてちまちま入れると、気泡が混じったり、不均一なカラムになりやすいので、専用のリザーバーを使ってカラム内に充填することを薦めます。

(無題) 削除/引用 No.3363-6 - 2014/09/10 (水) 13:46:50 - おお >[Re:5] 独り言さんは書きました : > ライセートをどうやって調製しているのかわかりませんが、界面活性剤で溶かして普通の遠心しているだけでは、デブリスがまだまだ残りますよ。 > フィルターで濾過するか超遠心しないとカラムが詰まるでしょ。 私もこの点がきになります。細胞などから直接調製した初段階のものはなるべく分離目的のゲル濾過にかけないほうがいいともいわれてます。ゲル濾過でなくても高分解能な目の細かいイオン交換も避ける方がぶなんです。 バッチ吸着とかで目の粗いイオン交換ゲルや疎水クロマト用げるで粗精製するとか、あるいは目の粗いG-25(Coarse)など通しておくなどすれば、目詰まりが防げる場合が多いでしょう。 もちろん超遠心もてで、わたしもすることがありますが、ゲルに接触してあグルようなものもありますので、、、

(無題) 削除/引用 No.3363-5 - 2014/09/10 (水) 13:13:59 - 独り言 ライセートをどうやって調製しているのかわかりませんが、界面活性剤で溶かして普通の遠心しているだけでは、デブリスがまだまだ残りますよ。 フィルターで濾過するか超遠心しないとカラムが詰まるでしょ。

(無題) 削除/引用 No.3363-4 - 2014/09/10 (水) 13:10:48 - おお もし平衡化で圧がかかってなければ、サンプル注入の初期はすっと入っていくと思いますけど、そう言った感覚はないでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3363-3 - 2014/09/10 (水) 12:58:20 - TT 平衡化はポンプ、サンプルのゲルへの注入は手動のため、同じ圧が必要かは不明です。サンプルは界面活性剤で処理後の遠心上清です。ドロドロはしていないと思います。上澄みに多少デブリは含みましが、これまでは大きな問題はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3363-2 - 2014/09/10 (水) 11:04:15 - おお カラムをバッファーで平衡化するときも同じぐらい圧が必要ですか? サンプルの調製法をもう少し詳しく教えてください。ドロドロしてませんよね。 ローディングとか、そうでない場合もペリスターポンプは使うことがあると思います。

セファロースカラムが詰まる 削除/引用 No.3363-1 - 2014/09/10 (水) 10:52:01 - TT 高分子分離のためにCL4Bセファロースカラムを使っています。細胞抽出液をかけています。流速が一定にならず、抽出液をインジェクションする際もかなりの力をかけてシリンジで注入しないとゲルに入っていきません。まだカラムは数回しか使っておらず、抽出液由来の沈殿などが邪魔してるとも考えにくいです。カラム充填は自身で行いました。原因が不明なためひとまず新品のカラムを充填し直す予定ですが、充填が十分でなかった場合にゲルが詰まることはありますでしょうか？ あとみなさまはゲルへのサンプル注入はどのようにされていますか？教わった方法が、サンプルをカラムにロードした後に、10mlのシリンジをカラムに繋いで自身でピストンを押して圧で入れるのですが、時間、力が必要で大変な重労働です。

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