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培養細胞からのライゼート 遠心後の不要物 トピック削除
No.3362-TOPIC - 2014/09/10 (水) 10:32:55 - ken
培養細胞を界面活性剤バッファーRIPAで回収、ホモジナイズ、14500rpm,45min遠心して上清回収しています。
上清に多くはないものの全く沈殿していない、むしろ浮いている感じの不要物があります。次のステップのために除きたいのですが、フィルターはかけたくありません。恐らくこの不要物が原因で時々実験がうまくいかないときがあります。頻発するわけではないため、マイナーチェンジで留めたいのですが、何か方法はございますでしょうか？
　
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No.3362-11 - 2014/09/11 (木) 00:19:18 - おお
>[Re:9] Zさんは書きました :
> おおさんはいつも様々なジャンルにコメントされていますね。
> 実はめちゃくちゃすごい研究者？

実はここでいろいろなことを教わりました。

(無題) 削除/引用
No.3362-10 - 2014/09/10 (水) 13:16:09 - 独り言
浮いているんなら脂質じゃないの。フィルター使いたくないなら、超遠心で。

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No.3362-9 - 2014/09/10 (水) 13:12:18 - Z
おおさんはいつも様々なジャンルにコメントされていますね。
実はめちゃくちゃすごい研究者？

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No.3362-8 - 2014/09/10 (水) 13:08:08 - おお
もやもやした感じで完全にちんでんしないようなやつだったらDNAかもしれないね。

RIPAを少なめにしてlysisするとゲノムは出にくくなりますけど、あとグリセロールが入ってなければ10%ぐらいいれるとゲノムの溶出はふせげることがあります

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No.3362-7 - 2014/09/10 (水) 12:59:16 - cc
DNAかな
もしそうなら、ソニケーションで解決するかも
ChIPに使うとかなら、ダメですけど

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No.3362-6 - 2014/09/10 (水) 12:24:23 - おお
それならえんしんしてえられたlysateにカラムと同じ支持体のゲルをvolumeの1/10以下で加えてpreclearするという手もあるかもですね。

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No.3362-5 - 2014/09/10 (水) 12:08:05 - TT
早速にありがとうございます。２回目の遠心で底から回収、ブレーキを弱める、両方試してと思います。つぎのステップはスピンカラムです。目詰まりのようなことを起こしたことがあり、ぞの原因が不要物でないかと。

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No.3362-4 - 2014/09/10 (水) 11:47:36 - おお
ちなみに次のステップはなんでしょうか、、、かいじできるのなら

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No.3362-3 - 2014/09/10 (水) 11:31:02 - mon
浮遊物が沈殿の舞い上がりなら、遠心時のブレーキを弱める・０にすると、それを防ぐことができます（出来ることがある）。

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No.3362-2 - 2014/09/10 (水) 11:12:09 - おお
脂質成分ではないかと。。。なのでRIPAの容量をふやすと解決するかもしれませんが、保証の限りではありません。脂質成分ならバッファーにBSAを加えるなどいうてもありますが、たいていじゃまになるでしょうね。

あるいはえんしんしたあと、上澄みをとって、もう一度えんしんして、こんどはチップを底までいれて下から溶液をとり、全部とらないで上に浮いている不溶物を含んだ溶液を捨てるというのもありかもしれません。

培養細胞からのライゼート 遠心後の不要物 削除/引用
No.3362-1 - 2014/09/10 (水) 10:32:55 - ken
培養細胞を界面活性剤バッファーRIPAで回収、ホモジナイズ、14500rpm,45min遠心して上清回収しています。
上清に多くはないものの全く沈殿していない、むしろ浮いている感じの不要物があります。次のステップのために除きたいのですが、フィルターはかけたくありません。恐らくこの不要物が原因で時々実験がうまくいかないときがあります。頻発するわけではないため、マイナーチェンジで留めたいのですが、何か方法はございますでしょうか？
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