BioTechnicalフォーラム [cdc25Aに関して]

cdc25Aに関して

No.3361-TOPIC - 2014/09/09 (火) 16:54:29 - ccc

こんにちは。
最近、新たに取り組んでいる実験に関して、みなさまの意見が聞きたいです。

cdc25Aに関してですが、ある細胞Aとその変異株である細胞aに関して調べています。
両方の細胞とも、細胞質蛋白質、核蛋白質を別々に調製し、cdc25Aの発現を確認しました。（WB）
核の方は両細胞とも同じ程度の発現量でしたが、細胞質蛋白質の方は、細胞aの発現の方が明らかに高くでました。

論文から、ATM経路（DNAダメージの経路）を参考にしてcdc25Aの上流であるATMの発現も確認しましたが、ATMの発現は、細胞質ではまったくなし。核で、細胞Aの方が明らかに高くでました。

ここで疑問が２つあるのですが。
まず、cdc25Aは細胞質と核で結果が異なっていたのですが、局在についてのっている論文がうまくみつけられず、どのように理解したらよいのか悩んでいます。

もう一つは、ATMの発現は、核で細胞Aが高かったのに、cdc25Aは細胞質で細胞aのが高かったというのは矛盾しているように思います。
ATMのリン酸化も確認したのですが、バンドが検出できませんでした。
これは、たまたまATMの発現にも違いがあったが、cdc25Aの発現には関与していないということでしょうか？
実際、cdc25AはDNA損傷経路の他に、細胞周期に関連があると調べて分かったので。

詳しい方がいらっしゃいましたら、意見を頂きたいです。
また、参考になる論文などありましたら教えて頂きたいです。
よろしくお願いします。
　

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(無題)

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No.3361-8 - 2014/09/12 (金) 10:24:10 - ccc

>[Re:6] おおさん

> ATMが活性の制御に関与しているというスキームはよく見ますが発現に関与しているというのは詳しくわかりません。活性の制御にタンパク質の分解もかかわってますけどそう言うことでしょうか?後学のためにそれをしめした論文などをみたいと思います。ご提示ねがいますか?

> 活性の制御にタンパク質の分解もかかわってますけどそう言うことでしょうか?
→その通りです。論文の内容ではなく、pathwayの図からそのように考えました。
ただ、もともと何らかの原因でATMの発現自体に差があるのならば、自然と発現の低い方は活性も低く、、、という結果になりそうだと考えています。

(無題)

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No.3361-7 - 2014/09/12 (金) 09:54:38 - ccc

>[Re:4] おおさん

> ATRも関与しているよね。DNA damageなど刺激をあたえてからみてるんでしょうかね。。。そうでなければうまくリン酸かとか見れないかも。

条件としては、血清欠如の状態で培養したものと、通常培養のものとの比較をしています。
通常培養の時点から、ATMとcdc25Aの発現には違いがありましたが、血清欠如で増強していました。
低血清がDNA damageにつながるのか分からないので、リン酸化をみるなら報告のある方法を用いて検討してみる必要がありそうですね。

> cdc25Aの細胞しつでの役割ってなんでしょうかね。あとM期の細胞が増えると、その時は核が崩壊してますので、核蛋白が細胞質に出てきたように見えるかもしれません。

細胞周期の制御に関わっていると予想しているのですが。
ただ、実際cdc25Aの発現に差があったとしても、それより下流のcyclinに異常が出てくるのは、もっと後（時間的に）でしょうか？
蛋白質を調製するタイミングが難しそうですね。
ちなみに、PCRでは細胞周期はどこかに偏りがあるということはありませんでした。

(無題)

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No.3361-6 - 2014/09/10 (水) 00:34:20 - おお

>[Re:1] cccさんは書きました :
>
> こんにちは。
> 最近、新たに取り組んでいる実験に関して、みなさまの意見が聞きたいです。
>
> cdc25Aに関してですが、ある細胞Aとその変異株である細胞aに関して調べています。

こまかくみていくと、、、まず変異というのは漠然ですが、、、どんな変異でしょうか。。。

> 両方の細胞とも、細胞質蛋白質、核蛋白質を別々に調製し、cdc25Aの発現を確認しました。（WB）
> 核の方は両細胞とも同じ程度の発現量でしたが、細胞質蛋白質の方は、細胞aの発現の方が明らかに高くでました。

totalでどの程度差が認められますか。degradationのスピードもあるので一概にいえませんが、、、発現が上がっているのか、核、細胞質のバランスが変わっているのかの指標にはなると思いますが、、、mycによってtranscriptionalに発現制御されてますよね。

>
> 論文から、ATM経路（DNAダメージの経路）を参考にしてcdc25Aの上流であるATMの発現も確認しましたが、ATMの発現は、細胞質ではまったくなし。核で、細胞Aの方が明らかに高くでました。
>
> ここで疑問が２つあるのですが。
> まず、cdc25Aは細胞質と核で結果が異なっていたのですが、局在についてのっている論文がうまくみつけられず、どのように理解したらよいのか悩んでいます。

ttp://mcb.asm.org/content/21/14/4818.full.pdf
とかぐぐってもけっこうでてきそうですけどね。。。
ttps://www.google.com/webhp?sourceid=chrome-instant&ion=1&espv=2&ie=UTF-8#q=cdc25a+cytoplasm

>
> もう一つは、ATMの発現は、核で細胞Aが高かったのに、cdc25Aは細胞質で細胞aのが高かったというのは矛盾しているように思います。

矛盾というのがよくわかりませんけど、、、実験事実(ちゃんと結論付けれる結果じゃないといけませんけど)から考察するべきものではないでしょうか。それとも実験系自体に疑問があるのでしょうか?それなら実験条件など提示して議論するべきかとおもいますけど。

> これは、たまたまATMの発現にも違いがあったが、cdc25Aの発現には関与していないということでしょうか？

ATMが活性の制御に関与しているというスキームはよく見ますが発現に関与しているというのは詳しくわかりません。活性の制御にタンパク質の分解もかかわってますけどそう言うことでしょうか?後学のためにそれをしめした論文などをみたいと思います。ご提示ねがいますか?

(無題)

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No.3361-5 - 2014/09/09 (火) 23:54:25 - おお

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22263797

(無題)

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No.3361-4 - 2014/09/09 (火) 22:40:31 - おお

http://www.nature.com/nrm/journal/v5/n10/fig_tab/nrm1493_F2.html
ATRも関与しているよね。DNA damageなど刺激をあたえてからみてるんでしょうかね。。。そうでなければうまくリン酸かとか見れないかも。

ATRも関与しているよね。DNA damageなど刺激をあたえてからみてるんでしょうかね。。。そうでなければうまくリン酸かとか見れないかも。

cdc25Aの細胞しつでの役割ってなんでしょうかね。あとM期の細胞が増えると、その時は核が崩壊してますので、核蛋白が細胞質に出てきたように見えるかもしれません。

(無題)

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No.3361-3 - 2014/09/09 (火) 18:20:14 - ccc

>[Re:2] 想像さん
貴重なご意見ありがとうございます。

> cdc25関係は、信頼できない論文も多いような感じで特に局在については要注意。IFでリピートするなら、そういう現象である、ということで放置するのがよいかもしれない。

貴重なご意見ありがとうございます。

> それは変異の種類とそれによる機能変化にもよるし、矛盾するかもしれない、とはいえない。ATMの活性化だとリン酸化抗体での活性の変化のチェックは必須。それとATM刺激ありなしで、cdc25Aの減少率の差がでることが本質的なのでは？　ある論文のいうことがもし本当ならば。
>

ATM-chk2-cdc25Aの経路を見た時、ATMの活性が高いと、その下流のcdc25Aの発現も高くなると考えていました。
しかし実際は、ATMの発現は細胞A（核蛋白）のが高かったのに、cdc25Aは細胞a（細胞質蛋白）のが高く、これでは経路に矛盾していると考えました。
ただし、ATMのリン酸化が確認できていない以上、この経路が活性化しているとは考えづらいという印象です。（ATMのリン酸化がうまくWBでみれていないだけかもしれませんが・・・。350kDaという高分子蛋白なので、なかなか苦労してます。）
ATM経路とは関係のないcdc25Aの経路などがないか、現在文献を検索しています。
もし参考になる論文や知識をご存知であれば、ご意見頂きたいです。

(無題)

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No.3361-2 - 2014/09/09 (火) 18:05:49 - 想像

> まず、cdc25Aは細胞質と核で結果が異なっていたのですが、局在についてのっている論文がうまくみつけられず、どのように理解したらよいのか悩んでいます。

cdc25関係は、信頼できない論文も多いような感じで特に局在については要注意。IFでリピートするなら、そういう現象である、ということで放置するのがよいかもしれない。

> もう一つは、ATMの発現は、核で細胞Aが高かったのに、cdc25Aは細胞質で細胞aのが高かったというのは矛盾しているように思います。
> ATMのリン酸化も確認したのですが、バンドが検出できませんでした。
> これは、たまたまATMの発現にも違いがあったが、cdc25Aの発現には関与していないということでしょうか？

それは変異の種類とそれによる機能変化にもよるし、矛盾するかもしれない、とはいえない。ATMの活性化だとリン酸化抗体での活性の変化のチェックは必須。それとATM刺激ありなしで、cdc25Aの減少率の差がでることが本質的なのでは？　ある論文のいうことがもし本当ならば。

cdc25Aに関して

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No.3361-1 - 2014/09/09 (火) 16:54:29 - ccc

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