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(追記） 削除/引用 No.336-12 - 2012/03/29 (木) 22:19:17 - mon >このタンパクの結合部位は細胞の種類により大きく変わります。 という意味は、（先ほどの質問にも関係するのですが）「レポーターアッセイによると、細胞によって転写活性が上昇する配列が異なる」ということでしょうか？ もしそうだとすると、その転写活性のばらつきに目的タンパク質が関与している根拠はなにでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.336-11 - 2012/03/29 (木) 21:46:52 - mon > 私の研究しているタンパク質はDNAに直接結合するかはまだわかっていません。しかしながら、その結合部位(エンハンサー)の一部はレポーターアッセイで活性が高くなることがわかっています。 この文章は？？？ですね。後半の文章は、 「しかしながら、そのタンパク質を含む複合体のDNA結合配列は数種知られており、そのうちのいくつかはXYZプロモーター活性を上昇させることがレポーターアッセイで判明しています」という意味ですか？ あるいは、「しかしながら、そのタンパク質が作用する（あるいは活性化する）転写因子（DNA結合タンパク）のDNA結合配列は数種知られており、（以下同文）」という意味ですか？ >このタンパクの結合部位は細胞の種類により大きく変わります。 「結合部位」の意味は、DNA配列ですか、それとも相互作用する他のタンパク質という意味ですか？

遅くなりました。DNA結合活性 です。 削除/引用 No.336-8 - 2012/03/29 (木) 21:23:55 - TF いろいろな回答寄せて頂きありがとうございます。 みなさまがおっしゃる通り、ベクターを作るのが最善なのかもしれません。 ベクターの構築については私も以前よくやっていましたが、何十と作成するのは今の研究室では難しいので何か効率の良い方法を考えたいです。 私の研究しているタンパク質はDNAに直接結合するかはまだわかっていません。しかしながら、その結合部位(エンハンサー)の一部はレポーターアッセイで活性が高くなることがわかっています。それが今回レポーターアッセイに使用された以外の細胞で活性を調べたいということです。 当たり前と思われますがこのタンパクの結合部位は細胞の種類により大きく変わります。 そのため、レポーターアッセイによって、そのタンパク質の活性を直に調べたい時、「�@その細胞内のおけるタンパクの結合部位を同定する→�Aそのサイトを含むベクターを構築する→�Bレポーターアッセイ」という手順になると思います。しかしながら、目標期間内にこれらすべてを終えるのは難しいと感じたため、他に効率の良いメソッドがあればと思い今回投稿させて頂きました。 勉強及び説明不足のため多数の混乱が生じたこと深く反省致します。

DNA結合活性？ 削除/引用 No.336-7 - 2012/03/28 (水) 10:48:46 - mon もしかして、転写（調節）因子のDNA結合活性を測定したいのでしょうか？ それでしたら、(1)核(or 細胞）抽出液とラベルした結合配列の2本鎖オリゴDNAを用いたgel retardation assay (gel-shift assay)が汎用されています。NFkBあたりが有名ですね。キットも売っていたと思うので、manualを読んでみたらいかがでしょうか。RI標識ではなく蛍光ラベルオリゴやビオチン化オリゴでも可能です。 あくまでも転写活性なら、皆様のコメントの繰り返しになりますが、(2)目的因子のDNA結合配列を適切な（最小？）プロモーター配列に連結した人工プロモーターを用いたレポーターアッセイが必要となりますね。もしくは、(3)目的因子のDNA結合配列を含んだ天然の遺伝子由来プロモーター配列を利用したレポーターアッセイが考えられます。 TFさんは(2)を想定しているのでしょうか？？？元々、(2)は(1)を手間無くnon-RIで行うために開発されたようなものです。最近は2本鎖オリゴDNAを固相化したサンドイッチELISAキットも市販されていますね。 もし、調べたいものがDNAに結合しない転写調節因子なら、それが発現調節に関与する遺伝子由来のプロモーターを利用した(3)のパターンになります。

(無題) 削除/引用 No.336-6 - 2012/03/28 (水) 09:01:40 - ~ 条件を振りたいのは転写因子？それとも転写調節因子？それとも生体の条件？ >手に入らないのは転写因子結合部位を含んだベクターのことです。 普通は、自分が必要とする転写調節因子を含んだベクターは売られていません。 そのため、こう言われても”何を当たり前のことを言っているんだ”としか思えません。 >確かにベクターを作ることは可能なのですが、一部の結合部位しか活性を持っていないため、結合部位をもったベクターを多数作成する必要があるので実現性が低いということです。 高校生が春休み中にちょっと実習をしたいという話ではありませんよね？ 自分の実験系に必要な配列をクローニングして、使いたいベクターを作るのは普通の対応です。 十数〜数十個作るのは普通のことですし、 1000個作らないといけないというのであれば効率のいい実験方法を考えたほうがいいかもしれません。 また、金さえ払えば、ベクターコンストラクションを請け負う受託会社もありますよ。 レポーターアッセイのコンストラクトを作るのが嫌というのであれば、 ・既知の下流の遺伝子を定量的PCRやノーザンブロット解析で定量する ・既知の下流の遺伝子の片方のアリルに適当なレポーター遺伝子をノックインして、それで見る ・遺伝子発現の結果細胞に起きる変化で判定する などは不可能ではないでしょうけれども、レポーターアッセイよりも大変かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.336-5 - 2012/03/26 (月) 21:53:53 - AP 材料や情報として何を持っていて、何を明らかにしようとしているのかがわかりません。 たいていのことはオーソドックスな方法でアプローチできるはずで、それでは不可能で別の方法を模索するにも、オーソドックスな方法をスキルとして持っていないと難しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.336-4 - 2012/03/26 (月) 19:05:34 - TS >確かにベクターを作ることは可能なのですが、一部の結合部位しか活性を持っていないため、結合部位をもったベクターを多数作成する必要があるので実現性が低いということです。 結合サイトが決まっているということ?　当たり前ですけど。 なぜいきなり多数作成する?　実現性が低い？　 すみませんが、ぜんぜんわかりません。 もう少し勉強して、おとなしくプロモーター領域をクローニングしたら。

(無題) 削除/引用 No.336-3 - 2012/03/26 (月) 18:53:25 - TF 文章がおかしくて申し訳ございませんでした。 手に入らないのは転写因子結合部位を含んだベクターのことです。 確かにベクターを作ることは可能なのですが、一部の結合部位しか活性を持っていないため、結合部位をもったベクターを多数作成する必要があるので実現性が低いということです。

(無題) 削除/引用 No.336-2 - 2012/03/26 (月) 18:14:47 - AP >その転写因子結合部位を含んだベクターによりレポーターアッセイをしようと思いましたが事情により手に入りそうにありません。 なにが手に入らないと言っているのですか？ 手に入らなかったらつくる、代替品・代替法を使うなどの選択肢は？（手に入らないと言っているのが何であるかによりますが）。

転写因子の活性の検出方法 削除/引用 No.336-1 - 2012/03/26 (月) 17:55:10 - TF ある転写因子(遺伝子活性化因子)の細胞内における活性を調べるため、その転写因子結合部位を含んだベクターによりレポーターアッセイをしようと思いましたが事情により手に入りそうにありません。何か良い転写因子の活性を検出する方法を知っておられたら教えてください。 　 できればレポーターアッセイのように直で細胞内の転写因子の活性を検出する方法がいいです。

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