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(無題) 削除/引用 No.3356-13 - 2014/09/09 (火) 22:26:21 - おお グリコシル化した蛋白はご指摘のような形状のバンドになりがちです。いちどグリコシル化した蛋白でなってないか確認されたらどうでしょうか。 これに関しては解決方法はあまりないかもしれませんけど、ゲル濃度をあげるとシャープになることはあるかもしれません。とう鎖を全部きってからという手もあるかもしれませんが、、、それにかんしてはなんともいえませんね。 えいどうの時の電圧など高すぎると解像度が落ちる可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.3356-12 - 2014/09/09 (火) 22:16:34 - 名無し Overloadingじゃないかな。蛋白質総量が通常のウェスタンの場合と比べて大杉という意味でなくて、（たとえloadingしてる蛋白質総量としては適正あるいは少なめでも）その蛋白質を検出する上で必要以上にloadingしているかもしれないということで。そういうことがあると、いろいろおかしなことがおこりやすい。シグナルが飽和しかかってたり、操作過程で、過剰の蛋白質が脱落したりとかするので。 なので、じゃあどうすればいいかというと、とりあえず検量線描いてみて、どのくらいまでのアプライ量なら定量性があっていいかんじのシグナルになるかをまず把握してから、その条件で本番の実験をしたほうがいいとおもう。（シグナル強すぎ弱すぎ、いずれも正確な定量に影響しやすい）Westernは定量的な解析はあまり適切でない方法なので（てか半定量くらいのかんじ。でも、他によい方法が無い事も多いので、まあ現実的にはこれでやるしかないのでないわけだが）すくなくとも2倍とか、目で見ても分かるくらいの差異がないと、定量結果が実際の画像データを正しく反映してるかといわれると、かなり厳しいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.3356-11 - 2014/09/09 (火) 17:50:48 - め 泳動パターンが乱れていないということなので、ゲルの問題ではなく検出時の問題のような気もします。 beta-actinやgapdhは問題ないということですが、内部標準は検出する際の露光時間が短いと思います。おかしなバンドがでるタンパク質の露光時間が内部標準に比べてかなり長いということはありますか？ また、2種類の蛍光色素で見ていますが、どちらの蛍光色素標識二次抗体でも同じような症状がでるでしょうか。 もし可能であれば、HRP-ECL系の検出でも同じ症状がでるか、など考えられる原因を特定していくしかないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3356-10 - 2014/09/09 (火) 17:30:26 - m いろいろな可能性について回答頂き、ありがとうございました。 >ここでのサンプルとはタンパク質溶液のことでしょうか？ whole brainをタンパク抽出したものです。 >同じゲルではすべてのサンプル全部変なバンドとして出ますか? 全て変なバンドが出ます。また、ダンゴ状シグナルというのは 丸かったり、楕円のような形です。正確な所はわからないのですが、detectの感度を下げても、 2本のバンドがくっついてる（修飾等）というようにはあまり見えない印象でした。 ですが、おかしくなっている分子のいくつかは確かにグリコシル化を受けます。 今までウエスタンで分離できなかったものが、分離しかけているという状況かもしれませんが、 中途半端になるくらいなら、分離せず見たいと思っています。（ちなみにゲル濃度上げても状況は変わりませんでした） メンブレンをCBBで染めたのですが、パターンはきれいでした。 また、言われて初めて気づいたのですが、目的のシグナル以外のノンスペは、 だいたいきれいなバンド状の形をしています。 タンパク質固有の問題か、何か細かい条件（ゲル、可溶化など）が変わって、目的タンパク質のみ影響を受けているのでしょうか。（今まで上手く行っていたのが、しばらくぶりに再開して問題が起こりだしたので） ＞サンプル調整はどの様に行ってますか? TNE bufferでホモジナイズしたtissue溶液に、サンプルバッファーとDTTを添加し、 5分boilした後使用しています。 サンプル調整で改善するかも？と思いまして、（なぜ急にだめになったかの根本的解決には つながらないかもしれませんが）本日、可溶化の条件をふって（boil時間、boilせずRTでONなど）流してみています。

(無題) 削除/引用 No.3356-9 - 2014/09/08 (月) 23:03:18 - おお 同じゲルではすべてのサンプル全部変なバンドとして出ますか?サンプル調整はどの様に行ってますか?串だんご状というのばバンドらしきものが連なっているんでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3356-8 - 2014/09/08 (月) 18:33:26 - ~ 実はリン酸化等の修飾があり、団子状の方はそれを分離できている、ということはありませんよね？ ゲルの出来に起因したバンドの分離の不具合と思いますが。 >ちなみに、複数抗体と書いて紛らわしかったのですが、β-actin、gapdhなどでは >同サンプルを使用しても、変なバンドが出たことは一度もなく、結果も安定しています。 ここでのサンプルとはタンパク質溶液のことでしょうか？ メンブレンのことでしょうか？ 前者であれば、一度、団子状に目的タンパク質が検出されるメンブレンで、アクチン等を検出してみるか、ポンソーS等で染色してみてはいかがでしょうか。タンパク質全体の分離が悪いのか、目的タンパク質固有の問題化の判別ができるでしょう。 後者であれば、目的タンパク質のみが分離されることを確認できれば、修飾等による可能性が見えてきますので、面白い方向に研究が進むかもしれませんね。 ゲルがダメという結論になり、かつ自作のゲルで何とかしたいというのであれば、メンブレンをポンソーSで染めたり、プレステインのマーカーのバンドの形を確認して、出来のいいメンブレンを使うというのも一つの手かもしれません。 その手間と、プレキャストゲルのコストがどうバランスするかは、ラボ次第ですが。

(無題) 削除/引用 No.3356-7 - 2014/09/08 (月) 18:26:04 - め 検出後でもよいので、メンブレンをCBBなどで染めてバンドのパターンに乱れが無いか確認したことないですか？

(無題) 削除/引用 No.3356-6 - 2014/09/08 (月) 18:17:01 - mon アクリルアミド溶液の劣化かな？ 調製し直すか、フィルター濾過かな。

(無題) 削除/引用 No.3356-5 - 2014/09/08 (月) 17:46:12 - AP QCのしっかりした市販のプレキャストゲルでやる。 これが一番、効くと思います。

(無題) 削除/引用 No.3356-4 - 2014/09/08 (月) 17:37:58 - m ありがとうございます。 検出は、蛍光検出(700nm, 800nmの２種)で行っています。 ゲルおよびバッファーは自作です。 大体、一度の実験で、ゲルは2-4枚作製して行なっていますが、 同時作製したものを使っても、妙な形のバンドがでるもの、出ないものが ある印象です。 ちなみに、複数抗体と書いて紛らわしかったのですが、β-actin、gapdhなどでは 同サンプルを使用しても、変なバンドが出たことは一度もなく、結果も安定しています。

(無題) 削除/引用 No.3356-3 - 2014/09/08 (月) 16:41:19 - おお あと、ゲルやバッファーなどは自作でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3356-2 - 2014/09/08 (月) 16:39:53 - おお detection のシステムをおしえてください。フィルムですか?

定量ウエスタンが安定しない 削除/引用 No.3356-1 - 2014/09/08 (月) 15:35:18 - m 定量ウエスタンの結果が安定しない事態に、困っています。 バンドは出ます。ですが、同じ条件／抗体でも、シグナルの形が一般的なバンド状（線のような）ものがピシっと出る場合と、ダンゴ状のバンド（？）が出る場合があります。 複数抗体試して（サンプルは同じ）、似た状況なのです。 なぜ同じ条件で、ウエスタンの様子が異なるのか分かりませんが、 ピシっとしたバンドが出た場合、差がとれるのですが、形の妙なバンドが出た場合、全体的に定量性が失われて、ばらつくため、特に有意差は全くとれなくなります。 （すでに有意な変化があることがわかっているサンプルでも） 定量ウエスタン自体何度もやっている操作で、何が原因で、どうすべきかわかりません。 いつもと異なる点は、サンプル数が多いため、通常より目の細かいコームを使用して、 多サンプルを１枚のゲルにブロットしていることくらいなのですが・・。 同じような事を経験された方はいらっしゃらないでしょうか？

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