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(無題) 削除/引用 No.3354-12 - 2014/09/09 (火) 17:02:41 - うえ みなさまご意見ありがとうございました。 蛋白や抗体によるということで、室温２時間で試しにやってみようと思います。 大変参考になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3354-10 - 2014/09/08 (月) 20:01:31 - さく とりあえず結果を見るときは4℃オーバーナイトが多いです。 バンドが確認出来るか分からない場合（発現量が少ないかもしれないし、抗体がイマイチかもしれないし）、室温2時間だとバンドが出ないとか薄いとかなってしまって時間を長くした方が良かったかなぁと思うよりは、という程度です。 その後条件を詰めて反応時間を短くすることはよくあります。ウェスタンは色々変更できるパラメーターがあるので、バックグラウンドを下げて綺麗な写真を取ろうとすると地味に時間と労力がかかります…

(無題) 削除/引用 No.3354-9 - 2014/09/08 (月) 12:32:25 - あ 私たちはゲルからメンブレンにオーバーナイトでゆっくり転写して、ブロッキング以降を一日でやってます。サブマリンで２０Vです

(無題) 削除/引用 No.3354-8 - 2014/09/08 (月) 11:12:21 - TS 室温１〜２時間は、一般的なプロトコールと思う。 個人的には、4℃、オーバーナイトを私は好みます。 非特異のバンドが少なるなる印象を持っているのと、 おまけ的な理由ですが、 SDS-Pageから検出まで、一日でやるのは私は疲れるので。。。

(無題) 削除/引用 No.3354-7 - 2014/09/07 (日) 13:35:39 - 名無し 抗体、抗原の性質によるので、どっちがいいかは一概に言えないけど、経験では室温１時間でも普通に検出できるものが多い（もちろんそういう抗体は４C、O/Nでも同じように出るわけだが）気がする。質の良い抗体ならばたいていどっちでも大差ないのかなあと思ってる、てかそういう抗体は、かなりいいかげんなことやってもシグナルちゃんと出る。 非特異的な反応（high BG)は室温１時間の方がむしろ４C、O/Nよりも目立つこともあったので、かならずしも時間が長いほど非特異的シグナルが目立つということではないかもしれない。（IPではたしかに反応時間が長いほど非特異的吸着は目立つけど。）室温で振るので抗体によっては一部変性するのかもしれない。免疫学で出てくる、病気かなんかのときの冷式抗体とかみたく、反応が温度に依存する抗体もあるとかいうのもあるので、そういう特殊な性質の抗体も中にはあるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.3354-6 - 2014/09/07 (日) 12:12:40 - おお よほど検出が難しいほどの微量でなければたいてい室温1-2時間ででますけどねぇ。。。O/Nでやるとノンスペが目立つようになることもあります。

(無題) 削除/引用 No.3354-5 - 2014/09/07 (日) 10:12:22 - 774R そんなの抗体の反応性と目的タンパク質の量次第です。 極端な話、タンパクが多くて強い抗体なら10分でもバンドでますよ。 経験的に4℃オーバーナイトの方がよい結果が得られる感触ですが、室温短時間で十分な結果が得られるならそれで良いんじゃないでしょうか？ 試せばすぐにわかることだし、逆に聞かれてもそちらの抗体とサンプル次第なのでなんとも言えませんね。

(無題) 削除/引用 No.3354-4 - 2014/09/07 (日) 10:05:03 - qw メーカーのプロトコルに「4℃、オーバーナイト」と書いてある時、それはその抗体個別のプロトコルでないことが多いです。メーカー側のウェスタン保証としては、4℃、オーバーナイトで出なければ、メーカーの責任を認めないわけではない、という意味だと思います。私は、4℃で揺らす装置を持っていないので、室温2時間で検出できない抗体は、できれば使いたくありませんね。 同じ意味で、メーカーの示す抗体の希釈濃度も濃い目であることが多いと感じます。

(無題) 削除/引用 No.3354-2 - 2014/09/07 (日) 09:51:29 - おお 室温2時間とかもいっぱんてきです。

ウエスタンの一次抗体の時間 削除/引用 No.3354-1 - 2014/09/07 (日) 08:27:34 - うえ ウエスタンの一次抗体を反応させる時間ですが。 一般的には4℃、オーバーナイトだと思いますが、室温2時間とかでも反応しますか？ みなさんの経験などお聞かせください。 ちなみに、一次抗体、二次抗体ともに、cell signalingのものを使用してます。 希釈は、両方1000倍で、ブロッキング液やcan get signalで希釈してます。

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