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(無題) 削除/引用 No.3349-4 - 2014/09/05 (金) 20:42:48 - 名無し 一晩 in blocking bufferでもオーバーブロッキングは大丈夫かなあ---とか言う感じだから、かさすがに５日はないわな。いろいろ不安のある膜を使うよりも、急がば回れで、もう一度、新規に電気泳動からやった方がいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.3349-3 - 2014/09/05 (金) 20:17:48 - 独り言 スキンミルク２日とかならあるけど、特に一時間と変わらないと思います。 ５日でもちゃんと防腐剤いれてれば大丈夫だという気がするので、むしろストリッピングの問題とかじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.3349-2 - 2014/09/05 (金) 18:16:53 - TS >思い当たることとしては、5%スキムミルクでブロッキング（RT1h）後、4℃で5日程保存 オーバーブロッキングなのか、タンパク質が分解したか、バクテリアが食べちゃったか、いろいろ考えられると思うんですが、 ５日間ミルクは、あまりにも異常な保存状態と思いますので、 とりあえずきちんとしたプロトコルで再試験したうえで、検討すべきではないでしょうか。

ウエスタンブロットでバンドが出ない 削除/引用 No.3349-1 - 2014/09/05 (金) 16:36:28 - wite お世話になります。 ウエスタンブロットを行っているのですが、バンドがまったくでません。 露光時間を長くすると、メンブレンの形にぼやっと黒くなるのですが、バンドはまったくです。 思い当たることとしては、5%スキムミルクでブロッキング（RT1h）後、4℃で5日程保存していました。（ブロッキングにつけたまま） ちなみに、抗体はリン酸化抗体ではありません。 ブロッキングのやり過ぎでこういったことは起こるのでしょうか？ また、ストリッピングして、再びブロッキング（RT1h）後、すぐに抗体と反応させて（O/N）・・・と進めれば、またバンドが検出できるようになるでしょうか？ ちなみに、今回は別のバンドを検出後、ストリッピングして、ブロッキングに長時間つけていたので、蛋白はしっかり転写されていると思います。

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