最近免疫の実験を始めた者です。
現在PBMCよりDCの分化誘導を試みています。
初回は成功したのですが、その後2回連続して培養6〜7日目に細胞が死んでしまいました。(培養4日目くらいから死細胞の凝集塊らしきものが少しずつ出ていた気もします)。
細胞は細胞毒性のある物質を添加した時のようにモロモロ？状態で死んでいます。
方法はヒトの血液よりPBMCを回収し、MACSを用いてCD8+細胞をネガティブセレクションで分離した後、残りの細胞(成功時：1.8×10^7、失敗時：8.0×10^6、1.0×10^7)を100mm Dishに播種してDCへの分化誘導を行っています。
DC誘導としては初日にAIM-V+2%AutoSerumにて培養し、翌日の培養1日目に培地交換と共にGM-CSF、IL-4を終濃度1,000U/mlで添加、そして5日目にピシバニール(OK432)を終濃度0.1KE/ml添加して2日間matureさせます。
成功した際と異なるのは以下の点です。
・PBMC分離時の血液を希釈せずに全血を用いたのを2回目以降はPBSで2倍希釈してから分離に用いた。
・播種時の細胞数が少ない。
・初回はOK432を調製したてのフレッシュな状態で使用したが、2回目以降は4℃で保存した残りのものを用いた(2回目で調製から7日、3回目で調製から14日以上経過)。
次回、成功時と全く同じ条件で再度挑戦したいと考えていますが、採血の機会も少なくできる限り情報を集めておきたいと考えています。
同様の実験を行ったことのある方、何かお気づきの点等ございましたらご教授いただければと存じます。
|
|
このスレッドをはてなブックマークに追加