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(無題) 削除/引用 No.3337-15 - 2014/09/07 (日) 18:15:19 - なし 細胞懸濁液をシリンジ使って適当なふとさのニードルに勢いよく通すとかどうですか？ ラフト抽出はやったことないのでわかんないですが、顕微鏡で観察するとほとんどの細胞が壊れていたので破砕自体は問題ないと思います。ただ、細胞ロスるかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.3337-14 - 2014/09/05 (金) 22:55:23 - ぬぬぬ おお様　おっしゃる通りです。 あと界面活性剤処理後のホモジネートでvortex以外に良い方法はございますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3337-13 - 2014/09/03 (水) 06:24:00 - おお >[Re:12] ぬぬぬさんは書きました : > おお様 > > たくさんありますね。 > 困ったときは一度検索してみます。ありがとうございます。 というかいまそう言う文献を必要としているのではないかと、、、

(無題) 削除/引用 No.3337-12 - 2014/09/02 (火) 20:36:57 - ぬぬぬ おお様 たくさんありますね。 困ったときは一度検索してみます。ありがとうございます。 あ様 ラフトマーカーはカベオリンとフロチリンを使用しております。

(無題) 削除/引用 No.3337-11 - 2014/09/02 (火) 19:21:37 - あ ラフトマーカーは具体的には何ですか？

(無題) 削除/引用 No.3337-10 - 2014/09/02 (火) 13:05:05 - おお >[Re:6] ぬぬぬさんは書きました : > nature protocolですか。 > 恥ずかしながら、初めて伺いました。 > 早速調べています。他に、参考になるprotocolが載っているサイト、雑誌はたくさんあるんでしょうね。勉強不足を痛感しました。 むかしからあるやつだと、Methods in EnzymologyとかあとそれのスピンオフみたいななまえのMethods in ***というのが何種類かでてたような。またCurrent protocolシリーズも幅をひろげてきていますし。。。あとはanalytical biochemistryとか。analytical biochemistryはコンパクトな部分もあるので論文によっては情報量がすくないかも。また一般雑誌とか(たとえばJBCとか)でも、方法論という視点でかいた論文はあるとおもうし。

(無題) 削除/引用 No.3337-9 - 2014/09/02 (火) 13:01:39 - ぬぬぬ MP様　TS様 超音波は確かに一般的ではなさそうですね。 ダウンス型、ポッター型ホモジェナイザーなど種類はたくさんありそうですが、残念ながら、私のラボにはありません。 愚問ですが、Triton存在下でvortexをしばらく行うとかでは代用は難しいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3337-8 - 2014/09/02 (火) 12:33:36 - TS 超音波の条件次第とは思いますが、 わたしもダウンスやポッタータイプのホモジナイザーでしかやったことないです。 あんまり超音波がきついと、マイクロドメインはバラバラになりそうです。

(無題) 削除/引用 No.3337-7 - 2014/09/02 (火) 11:59:54 - MP Raft精製の際の超音波処理は一般的なのでしょうか？ 私の場合、Triton X-100は0.2％ で緩衝液にはMESを用いていました。 細胞溶解後、ダウンス型ホモジェナイザーで１０回程度ストロークしたものを、等量の80％ sucroseと混合し、その上に30％と5％のsucroseを重層、200,000g 18h Swingで回してました。当然のことながらすべての作業は4度で行っています。

(無題) 削除/引用 No.3337-6 - 2014/09/02 (火) 11:26:41 - ぬぬぬ 皆様 貴重なアドバイスありがとうございます。 fc1様 まだ他の濃度では検証できていません。 早速行ってみます。 おお様 nature protocolですか。 恥ずかしながら、初めて伺いました。 早速調べています。他に、参考になるprotocolが載っているサイト、雑誌はたくさんあるんでしょうね。勉強不足を痛感しました。 TS様 細胞溶解はTriton処理後、超音波で破壊しています。

(無題) 削除/引用 No.3337-5 - 2014/09/02 (火) 08:32:00 - TS わたしも1％が一般的かと思いますので、そこは試すべきかと。 それと、細胞溶解時にはどのような機器を使っていますか。

(無題) 削除/引用 No.3337-4 - 2014/09/02 (火) 04:33:50 - おお 脂質に対してデタージェントがすくないと、膜がフラグメントを起こすだけで、ラフとを含む膜フラグメントができて、raftとその他の領域の膜フラグメントの割合でいろいろな密度の膜ができて、分離を困難にするのではないかと想像します。

(無題) 削除/引用 No.3337-3 - 2014/09/02 (火) 04:28:11 - おお わたしも0.1は少ないと思ったのですが、文献を見てやっているということなのでコメント入れませんでした、、、もう少しいろいろなプロとコールを調べてみてはどうでしょうか。nature protocols etcのプロとコール中心の雑誌のarticleであれば最適化に考慮する点などもいくらか情報がある可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.3337-2 - 2014/09/02 (火) 01:35:16 - fc1 0.1%は一般的ではないですが、その濃度でのみ試されましたか？私なら1%で行ってみます。

脂質ラフトについて 削除/引用 No.3337-1 - 2014/09/02 (火) 00:05:57 - ぬぬぬ いつも参考にさせていただいてます。 現在超遠心密度勾配法を使用して、脂質ラフト分画を得ようとしています。 なかなかラフト分画が得られず苦労しています。ラフトマーカーは検出されるものの、均一でない感じです。 キーとなってくるのが a)　細胞溶解時の界面活性剤の種類、濃度 b) 遠心回転数(g) c) 遠心時間 と個人的に思っています。 現在は論文に報告されている通り、THP-1細胞で0.1% TritonX100を使用し、45000rpm(27万G)、16 hrで遠心しています。使用する細胞によって変わってくるとは思いますが、皆様は、経験的にどのようにして、ラフト分画を得ましたか? たとえば、遠心回転数をあげれば、超遠心時の分画でラフトマーカーが上側に来る etc...

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