いつも勉強させていただいてます。
現在、免疫沈降法を使用して、外分泌性タンパクと細胞膜上タンパク(脂質ラフトに存在)の相互作用を見ていますが、なかなかバンドがうまく現れません。
RIPA buffer(1％ NP40、0.5% Sodium Deoxy Cholateを含有するbuffer)で細胞を溶解していますが、検証はできないのですが、
@ 界面活性剤がタンパク-タンパク相互作用を切断している
A 脂質ラフトに存在するタンパクなのでうまくタンパクを可溶化できていない
のかなと考えています。
ちなみに、ドットブロット法で両者の結合性は証明できていますが、やはり免疫沈降法ほどの説得性がないので、免疫沈降法で証明したいと思っています。免疫沈降法について何かアドバイスをいただけないかと考えております。
また、現在は細胞に外分泌性タンパクを添加した後に細胞を溶解していますが、先に細胞を溶解後、外分泌性タンパクを添加する方法もあるようです。
この場合、細胞膜上タンパクとの相互作用を見ているとはいえないと思うのですが、皆様はどのようにお考えでしょうか。 |
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