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(無題) 削除/引用 No.3336-21 - 2014/09/05 (金) 22:50:53 - ぬむぬ 皆様　数々の経験談、アドバイスありがとうございます。 coIPのコツでSDS化も関わっているんですね。 あと、やはりラフトタンパクのcoIPは難しそうですね。名無しさんのように一度ラフトマーカーでIPしてみます。

(無題) 削除/引用 No.3336-20 - 2014/09/05 (金) 15:26:51 - 膜 いえ、サンプルバッファーを入れて電気泳動の前にO/Nした、ということです。 カルバモイル化勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.3336-19 - 2014/09/05 (金) 10:53:29 - おお >[Re:16] 膜さんは書きました : >膜タンパクは加熱しないほうがいいとのコメントでした。（カルバモイル化を抑えるため、と。） カルバモイル化は尿素存在下でおこるんじゃなかったでしたっけ。まく蛋白でなくても尿素存在下ではカルバモイル化の可能性はありますよ。

(無題) 削除/引用 No.3336-18 - 2014/09/05 (金) 10:31:39 - 774R >サンプルバッファーを入れて電気泳動の前にO/Nかと誤解していました。

(無題) 削除/引用 No.3336-17 - 2014/09/05 (金) 10:02:07 - qw オーバーナイトは、1次抗体との反応のことなのですね。サンプルバッファーを入れて電気泳動の前にO/Nかと誤解していました。

(無題) 削除/引用 No.3336-16 - 2014/09/05 (金) 00:53:18 - 膜 特別にCysが多いというタンパクではないと思います。私がやったのは、発現がネガティブな細胞にその遺伝子を導入後、qPCRとウエスタンで発現を確認しようとしました。PCRでは違いが見られたのですがプロテインでは出ず・・・検索をしていくうちに「何でも煮ればいいってもんじゃない」と、膜タンパクは加熱しないほうがいいとのコメントでした。（カルバモイル化を抑えるため、と。）新しい試薬や抗体、プロテイン調整方法を検討する前に、残っているサンプルで非加熱オーバーナイトで試してみたところきれいなバンドが出てPCRの結果ともほぼマッチしたので同僚と「違うものだねー」と感心したのを覚えております。加熱によってアグっていたという印象はなかったような、ただ出ていたバンドが薄かったです。（最初は抗体がよくないのかと思っていました。）オーバーナイトは4度でしました。経験談ばかりですみません。

(無題) 削除/引用 No.3336-15 - 2014/09/04 (木) 09:00:58 - 774R GPCRとか7回膜貫通タンパクを煮るとアグってゲルに入っていかないのはよくあるそうですよ。

(無題) 削除/引用 No.3336-14 - 2014/09/04 (木) 08:02:42 - qw 膜さん ＞SDS, b-MEを加えた後にボイルをせずオーバーナイトで反応 膜さんの調べていたタンパクは、特別にCysの多いタンパクだったのでしょうか？ それとも、ボイルでアグリゲートが原因らしいのでしょうか？ オーバーナイトで反応の温度条件は何度でしょうか？ もしよければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3336-13 - 2014/09/04 (木) 00:19:06 - 膜 以前、膜蛋白の発現をみたかったとき、ウエスタンできれいなバンドが出なく、IPをしても全然見えないときがありました。文献を検索するとほかのラボではきれいなバンドが出ており、マテメソを読んでも特別な方法でもなく、メールで問い合わせるのも何だしどうしようかと思っておりました。その後、いろいろと検索をし、SDS, b-MEを加えた後にボイルをせずオーバーナイトで反応させてからウエスタンをしたところきれいなバンドを得ることができました。（IPでのオーバーナイトは試しておりません。）関係なさそうでしたらごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.3336-12 - 2014/09/03 (水) 10:22:12 - 膜タンパクに苦戦 No.3336-10 の方に質問したいのですが、 ＞単独では沈殿しにくくても、細胞骨格とかとくっついてたりすると、ホモジネートを遠心してクラリファイする時に沈殿にいってるかも。 細胞骨格とくっついてるといっぱい引き連れてきてしまって候補を絞り込めないのですが、どうされていますか？なにか良い参考文献があれば教えて頂ければ幸いです。 ラフトって非イオン性界面活性剤で可溶化せずに、脂質とインタラクションしているのを利用して浮遊させている場合がほとんどだと思うのですが、可溶化してしまったら浮きませんよね。界面活性剤の効きってどう判断されているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3336-11 - 2014/09/03 (水) 08:07:30 - 774R そもそも、膜タンパク質はIP出来てることは確認したのかな？ 膜タンパク質はIPされてるけど外分泌タンパク質がco-IPされないのと、 膜タンパク質自体IPされてないのでは対処が全然違う。

(無題) 削除/引用 No.3336-10 - 2014/09/02 (火) 21:38:05 - 名無し ラフトって普通の膜画分とは違って、非イオン性界面活性剤に溶けにくい、特に低温ではかなり溶けにくい画分のことだったような気がするんだが、よくわかんないけど。一応DOCは入ってるけど、ラフトの膜蛋白質はちゃんとこのlysis bufferで確実に可溶化できてるかな。遠心条件にもよるとおもうけど、IPする前に既にどっかいってしまっているとかないかな。単独では沈殿しにくくても、細胞骨格とかとくっついてたりすると、ホモジネートを遠心してクラリファイする時に沈殿にいってるかも。ラフトのマーカー蛋白質（壁降りん、とか）の抗体で、沈殿（捨ててる？方）と上清（IPに使ってる方）両方ウェスタンしてみれば。

(無題) 削除/引用 No.3336-9 - 2014/09/02 (火) 15:09:19 - 774R 古典的な方法ですが、生理的条件に近い方法としては、膜タンパクを強制発現させた細胞に標識済みのリガンドを結合させる方法ですかね？ 標識は放射性ラベルを使ってカウントするか、蛍光ラベルをしてFACSで測定してやってたと思います。 この場合、ネガコンは膜タンパクを発現させていない細胞です。

(無題) 削除/引用 No.3336-8 - 2014/09/02 (火) 13:05:57 - ぬむぬ おお様 今回検討を行っている細胞膜上のタンパクは、複数の膜貫通型のものです。 また、ドットブロットではdetergent存在下でも結合はしました。 クロスリンクはぜひとも試してみたいと思っています。 おお様がおっしゃる通り、ドットブロット法も使いようによっては証明できそうですね。非常に参考になります。

(無題) 削除/引用 No.3336-7 - 2014/09/02 (火) 12:56:45 - おお ところでdot blotの実験系がよくわからないのですが、その系でdetergent 耐性とかチェックしてIP条件を決めるとかできないのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3336-6 - 2014/09/02 (火) 12:53:01 - おお 膜蛋白が一回の貫通型とか、結合に関与する細胞外ドメインがわかっているような場合、細胞外のドメインだけで蛋白をつくると、どっとブロットでもある程度信憑性が出るのでは?あるいは細胞外ドメインにタグをつけて、ELISAプレートなどにトラップして(tagがなくてもくっつけられるけど)、そこにその蛋白がつくかどうか。 バクテリアのリコンビナントでもできるかもしれませんが、修飾など気になるならそのリセプターの細胞がいドメインだけを分泌させてsoluble receptorを得るのもてかもしれません。 ただそのレセプターが複数の膜貫通をしていて、複数のさいぼうがいどめいんが結合に関与しているならむずかしくなります。しもちろん細胞をつかったほうがより生理的な条件にちかいのでベターかもしれません。 間接的ですが、そのリセプターの発現量を調せいして、発現量とそのタンパク質の細胞へのあふぃにティーをしらべるてもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3336-5 - 2014/09/02 (火) 12:14:32 - mon おおさんが提案したクロスリンクが良さそうな。 例えば、DSP, DTSSPなら、還元剤入りSDSサンプルバッファー中で切断されるので、複合体を回収後通常のWBと同様に扱えます。 http://www.dojindo.co.jp/letterj/145/commercial/02.html 但し、非特異結合も増えるので、Nagtive controlが重要になります。

(無題) 削除/引用 No.3336-4 - 2014/09/02 (火) 11:43:09 - ぬむぬ おお様 参考になるご意見ありがとうございます。 おっしゃる通り結合していない可能性もあるとは思います。 ただ、ドットブロットの結果がありますので、やはり細胞膜上でも結合してもおかしくないのではと考えています。 しかし、実際のところその検証はどうすればいいかが分からない状態です。 774×様 ドットブロット法では、実際の細胞膜上での反応とは異なるのとタンパクが丸裸な状態なので非特異的な反応が出やすいために免疫沈降法ほどのインパクトがないらしいです。

(無題) 削除/引用 No.3336-3 - 2014/09/02 (火) 09:19:08 - 774x ドットブロットで証明できている上で、免疫沈降が必要なのはなぜですか？

(無題) 削除/引用 No.3336-2 - 2014/09/02 (火) 00:25:24 - おお 詳細の議論の余地はありそうですが、それをすっ飛ばして細胞にその蛋白を添加したあと、クロスリンクしてしまえば見れるかもしれません。ところで結合してない可能性を考える余地はないんでしょうか。

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