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腹腔マクロファージの回収について トピック削除
No.3325-TOPIC - 2014/08/28 (木) 18:06:48 - ぬぬぬ
いつも勉強をさせていただいてます．

現在，マウスの腹腔からマクロファージを回収しようとしています．

いろいろ勉強していると，マウス腹腔からマクロファージを回収する方法として
@　マウス腹腔にcold-PBSを投与して，しばらく揺さぶり回収する方法
A　マウス腹腔にチオグリを投与して3-4日後に@と同様の方法で回収する方法
がありました．

@では，normalな腹腔マクロファージが回収でき，Aでは活性化したマクロファージが多量回収できるという認識でよろしいでしょうか．

私は，@の方法でnormalな活性化していないマクロファージを回収したいのですが，マクロファージ以外にも他の細胞も含有されてしまうのではないかと考えています．
中には，付着系plateに播種した際，付着した細胞をマクロファージととらえている方が多いようですが，その認識は合っているのでしょうか．

また，@で採取したマクロファージと，Aで採取したマクロファージとでは活性が異なると伺っているので，assayによって実験者がどちらかを選択するという認識でよろしいのでしょうか．

つたない質問ですが，どうかご教授いただけたら幸いです．
よろしくお願いします．
　
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検証を忘れずに 削除/引用
No.3325-3 - 2014/08/29 (金) 14:04:44 - KIO
”1時間で培地交換をする（よく洗いましょう）と強い接着性をもつMφは底面に張り付いていますが、普通の接着性のＤＣとか繊維芽細胞はまだ十分に接着していなくて取り除けます。”とありますが、
F4/80などマクロファージマーカーを利用したflow cytometryで検証すべきです。自分の経験ですが数時間後に洗浄してもマクロファージ以外の細胞がかなり残存していました。２４時間後に洗浄すると接着細胞の９０％以上はマクロファージマーカー陽性でした。
なぜ２４時間か？
詳細な検討はしていませんが特に常在腹腔細胞の場合、かなりＢ細胞が含まれ、そのＢ細胞が残存しています。Ｂ細胞が直接、ディッシュに接着しているのか、マクロファージとともに接着しているのかまでは検討していませんが。
なお腹腔浸出細胞の場合、もともとマクロファージの割合が高いので数時間後に洗浄しても接着細胞中のマクロファージの割合は８０％以上にはなるようです。
いずれにせよ、初めて実験するときは目的を達成しているかの検証は重要です。

まだ軽い活性化 削除/引用
No.3325-2 - 2014/08/28 (木) 20:57:24 - ema
>@では，normalな腹腔マクロファージが回収でき，Aでは活性化したマクロファージが多量回収できるという認識でよろしいでしょうか．

1ですと常在性ですが1匹あたり105とれれば良い方です。
Mφの活性化には数段階あり、チオグリコレーと誘導は誘導されてくるので軽く活性化していますがＮＯ産生能とかはなく、たとえば（色々分類はありますが）5段階中の2段目程度で106単位のMφが回収できます。のであっせには
私はペプトンもしくはチオグリコレート誘導に、LPSかけてNO産生をみたり等の実験していました。
ちなみにチオグリコレート誘導でもMφの回収も冷やした培地もしくはPBSを腹腔内にいれ、揺らして回収。液・シリンジしっかり冷やしていないと回収に時間がかかっているうちにシリンジ内接着してしまい、少ないなと思うことになります。


＞@の方法でnormalな活性化していないマクロファージを回収したいのですが，マクロファージ以外にも他の細胞も含有されてしまうのではないかと考えています．付着系plateに播種した際，付着した細胞をマクロファージととらえている方が多いようですが，その認識は合っているのでしょうか．

回収し、1時間で培地交換をする（よく洗いましょう）と強い接着性をもつMφは底面に張り付いていますが、普通の接着性のＤＣとか繊維芽細胞はまだ十分に接着していなくて取り除けます。ほとんどがMφとみなしてよいと思います。

腹腔マクロファージの回収について 削除/引用
No.3325-1 - 2014/08/28 (木) 18:06:48 - ぬぬぬ
いつも勉強をさせていただいてます．

現在，マウスの腹腔からマクロファージを回収しようとしています．

いろいろ勉強していると，マウス腹腔からマクロファージを回収する方法として
@　マウス腹腔にcold-PBSを投与して，しばらく揺さぶり回収する方法
A　マウス腹腔にチオグリを投与して3-4日後に@と同様の方法で回収する方法
がありました．

@では，normalな腹腔マクロファージが回収でき，Aでは活性化したマクロファージが多量回収できるという認識でよろしいでしょうか．

私は，@の方法でnormalな活性化していないマクロファージを回収したいのですが，マクロファージ以外にも他の細胞も含有されてしまうのではないかと考えています．
中には，付着系plateに播種した際，付着した細胞をマクロファージととらえている方が多いようですが，その認識は合っているのでしょうか．

また，@で採取したマクロファージと，Aで採取したマクロファージとでは活性が異なると伺っているので，assayによって実験者がどちらかを選択するという認識でよろしいのでしょうか．

つたない質問ですが，どうかご教授いただけたら幸いです．
よろしくお願いします．
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